廣州健侖生物科技有限公司研究所.徐華

●用途原理

    ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）是一種常用的免疫檢測技術(shù)，具有敏感特異、簡(jiǎn)便實(shí)用、標準穩定等特點(diǎn)，已經(jīng)成為被廣泛采用的檢測手段。然而，ELISA的工作準備煩瑣而復雜，許多試劑需要臨時(shí)配置，不僅費時(shí)費力，而且影響結果的重復性。

    為此，我公司吸收國內外先進(jìn)技術(shù)，結合自身成熟工藝，開(kāi)發(fā)出通用的即開(kāi)即用ELISA試劑盒，適應于各種抗原抗體ELISA的建立。該盒幾乎囊括了ELISA自包被到結果判斷過(guò)程中所需的各種關(guān)鍵性試劑，并已加工成工作狀態(tài)，達到開(kāi)盒即用的效果；同時(shí)還提供了具體詳細的操作流程和注意事項，可以協(xié)助操作者順利完成ELISA試驗。

    試劑盒讓ELISA操作變得簡(jiǎn)單、方便！

●試劑組成

1.空白微孔板(48/96T)             1套;		5.顯色劑TMB (4號液)              1瓶;
2.酶結合物稀釋液(1號液)      1瓶;		6.樣本稀釋液 (5號液)       1瓶;
3.洗滌劑 (2號液)          1瓶;		7.終止液    (6號液)      1支;
4.底物（3號液）                      1瓶		8.使用說(shuō)明書(shū)             1份;

●操作程序

包被流程

1.將包被蛋白用包被液按比例稀釋?zhuān)瑓⒖紳舛?/span>5ug—50ug/ml不等，純度高的蛋白濃度可以低一些，反之亦然；充分稀釋后，按100ul/孔準確加樣。2-8℃18小時(shí)。

2.甩去孔中液體，用0.05M氯化鈉溶液注滿(mǎn)各孔，再甩去。

3.加入封閉液，充分溶解混勻。按120ul/孔加入各孔。37℃2小時(shí)，甩去后拍干即可使用。臨時(shí)保存可以放入自封袋內，密封后置于2-8℃保存。

檢測流程

1.  樣本稀釋:用樣本稀釋液(5號液)將待檢樣本按合適比例稀釋(一般間接法ELISA為1：100)。

2.  加樣反應:每孔加已稀釋樣本100ul。同時(shí)設陰性、陽(yáng)性及空白對照各一孔?？瞻讓φ湛? 加入100ul樣本稀釋液(5號液)。37℃溫育,時(shí)間一般為30-60分鐘，甩去，每孔加洗滌液(2號液)一滴,立即用蒸餾水加滿(mǎn)，靜止30秒，甩去；如此洗滌五次,甩去,拍干。 

3.  加酶反應:將酶結合物用酶結合物稀釋液(1號液)按參考比例稀釋?zhuān)蟀?/span>100ul/孔加入, 37℃反應30-60分鐘。甩去,加洗滌液(2號液)一滴,立即用蒸餾水同上洗滌五次,甩去,拍干。

4.  顯色反應:加底物(3號液)和顯色劑(4號液)各一滴，混勻, 37℃下放置3-10分鐘,加終止液(6號液)一滴混勻,終止反應。

●結果判斷

1．肉眼觀(guān)察:淺于近于陰性對照為陰性; 呈明顯深于陰性對照的藍色為陽(yáng)性。

2．儀器判斷:450nm讀取O.D值,待檢孔O.D值大于陰性對照2.1倍者為陽(yáng)性.空白對照調零。當陰   性對照O.D值低于0.07時(shí),按0.07計算。

●     問(wèn)題與技巧

ELISA是一種敏感的免疫學(xué)檢測方法，容易受到各種因素的干擾。要保證實(shí)驗的可靠性，必須注意每個(gè)環(huán)節。以下是常見(jiàn)的問(wèn)題以及相關(guān)的解決方法：

1 包被不上抗原（抗體）：

* 包被抗原應是可溶性的，不溶性蛋白結合性能很差，比如一些重組蛋白包涵體、組蛋白、膠元旦白或脂類(lèi)抗原。

解決：可以采用改變包被液PH，采用尿素溶解，改變溶劑等方法將抗原變?yōu)榭扇苄浴?/span>

* 包被抗原分子量太小，如合成多肽類(lèi)。

解決：可以采用共價(jià)鍵結合模式，包被抗原。

* 包被抗原的濃度不夠。

解決：可以適當提高包被抗原量或選取高吸附包被板，但過(guò)度包被會(huì )形成疊層，反而影響實(shí)際

結合量，甚至造成本底升高。

* 包被液PH不當會(huì )改變蛋白質(zhì)的電荷狀況，直接影響空間結構及抗原表位。

解決：可以測定等電點(diǎn)（PI），并系列改變PH，以尋求最適的PH值。

此外，在包被抗體時(shí)，適當預先低度變性，可以增加包被量。

 

2 本底很高

* 抗原本身不純，如有交叉表位，或有雜蛋白成分等。

解決：雜蛋白可以通過(guò)鹽析、層析純化去除；而交叉表位處理較為復雜，需要在表位選擇時(shí)認真考慮。

* 包被板封閉不佳，在包被板上留有較多的空白。

解決：提高封閉劑濃度，選擇更有效的封閉蛋白。

* 樣本問(wèn)題，首先是稀釋不夠：間接法ELISA一般要求血清稀釋在1：50以上，其它體液可以濃度大一些；

解決：系列稀釋樣本，以選擇最佳比例。

* 其次，樣本高脂、高色素、溶血以及污染長(cháng)菌，都有可能造成本底上升；

解決：要采用新鮮無(wú)溶血標本，低溫凍存。

* 最后可能與樣本稀釋液有關(guān)，樣本稀釋液的PH、離子強度等都會(huì )影響非特異性結合；

解決：可以采用可靠的樣本稀釋液或自行調整PH、緩沖系等條件。

* 酶濃度過(guò)高，造成非特異性上升；

解決：應當選擇恰當酶濃度。

 

3 反應強度不夠

* 除與抗原活性、包被效果相關(guān)外，主要受酶結合物性質(zhì)和濃度的影響。一般，稀釋后的酶結合物失活很快，半衰期僅3天。

解決：采用本試劑盒的酶稀釋液可以有效保護酶活性，大大延長(cháng)酶反應能力。此外，采用高純度的二抗（有親和層析的單克隆抗體酶最佳）。

延長(cháng)反應時(shí)間也可以一定程度提高反應強度。

 

4 顯色問(wèn)題

* 全部白板。原因與漏加酶液，酶液失活，顯色體系失效等。

  解決：可以取確認正常的酶液20ul，直接滴加底物和顯色劑各一滴，觀(guān)察顯色情況。正常應在60秒鐘出現明顯蘭色，否則，應認為顯色體系有問(wèn)題，需要更換。

* 肉眼觀(guān)察顏色很深，酶標儀讀數卻很低。如儀器工作正常，往往是選擇的波長(cháng)不匹配。

解決：TMB顯色劑被硫酸終止后，呈黃色，應在450NM處測定（注意：另外一種顯色劑OPD則在492NM測定）。

* 定量測定抗原或抗體時(shí)，線(xiàn)性范圍窄。

  解決：ELISA的反應在O.D值0.2-1.0區間較為穩定，超出以后，系統誤差加大，變得不太穩定?？梢栽谡{整反應到此區間。

 

5 操作過(guò)程中的其它問(wèn)題與解決，見(jiàn)附表：