純化高轉染級別的質(zhì)粒DNA 

【工作臺流程】BENCH PROTOCOL

準備工作：

1.將RNase A 溶液加入P1緩沖液(Buffer P1)

2.加40ml96－100％乙醇(ethanol)于試劑盒的去內毒素水中(endotoxin-fre water)

3.可選：加 LyseBlue 試劑于 Buffer P1

4.檢查 Buffer P2是否有SDS沉淀precipitation 有沉淀可在37攝氏度下暖化溶解

5.Buffer P3 置于4攝氏度中預冷pre-chill

6.細菌擴增培養

補充：

1. 準備4-6個(gè)50ml新的或滅菌的離心管用于冷凍離心機下離心過(guò)夜菌液，2個(gè)用于接下來(lái)的菌塊重懸和與buffer混合
2. 1個(gè)無(wú)內毒素的30ml聚丙烯（不推薦聚碳酸酯，因為不耐乙醇）管子（最好用圓底的離心管以利于高速離心）用于收集洗提的質(zhì)粒DNA
3. 5個(gè)1.5ml的EP管用于收集抽提過(guò)程各步驟的產(chǎn)物用于實(shí)驗后分析和質(zhì)量控制
4. 準備1個(gè)冰浴盒用于步驟6
5. 準備室溫下的異丙醇10.5ml
6. 4攝氏度冰凍離心機和分光光度儀,瓊脂糖凝膠電泳

步驟：peocedure

A.細菌培養、收獲和裂解 bacterial culture,harvest & lysis

1.100ml高拷貝high-copy或250ml低拷貝low-copy過(guò)夜overnight LB培養菌液于冰凍離心機4攝氏度； 6000×g；15min

   從新鮮的抗生素平板上挑取一個(gè)單菌落，2-5ml抗生素LB液體初始培養基30攝氏度孵化約8小時(shí)（振蕩300rpm，注意孵化容器容積至少4倍于培養液）

   抗生素LB液體培養基稀釋初始培養液到1:500-1000。(高拷貝質(zhì)粒100-200ul初始培養液加于100ml培養基；低拷貝質(zhì)粒250-500ul初始培養液加于250ml培養基)37攝氏度300rpm振蕩12-16小時(shí)。(孵化容器容積至少4倍于培養液，培養至細菌密度約3-4×10⁹/ml，即離心后菌塊濕重約3g/L培養基)

   培養基配方：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化鈉 溶于800ml蒸餾水，用1 N NaOH 調pH值至7.0，用蒸餾水調整至1L。

   可將離心后菌塊-20攝氏度下冰凍保存暫時(shí)終止實(shí)驗。

2.于10ml Buffer P1中重懸浮resuspend細菌沉淀bacterial pellet，混勻

   必須重懸徹底，渦流振蕩器或移液器反復吹打至沒(méi)有菌塊

3.加入10ml Buffer P2，劇烈vigorously翻轉invert4-6次混合，置于incubate室溫5min

   在室溫孵化期間準備QIAfilter 過(guò)濾筒cartridge：在濾筒出水口outlet噴嘴nozzle擰上screw帽子，將濾筒置于管架備用

  加入buffer P2后不要使用渦流振蕩器(以免剪切細菌DNA)，裂解反應不要超過(guò)5分鐘。buffer P2用完要擰緊蓋子以免酸化。

4.加10ml預冷的 Buffer P3，劇烈翻轉4-6次混合

加入buffer P3后析出絨毛樣物質(zhì)(細菌DNA，蛋白，細胞碎片和KDS)，裂解液粘性下降。如果裂解液仍然粘稠度大，說(shuō)明混合不夠。

很重要的是混合好后迅速倒入濾筒，以防止擾動(dòng)沉淀層。

B.細菌裂解清除 bacterial lysate clearing

5.將裂解液倒入pour濾筒內，置室溫(15-25攝氏度)10min，不要套入濾筒活塞plunger！從噴嘴處取掉濾筒的帽子，緩慢輕柔的將活塞插入濾筒并濾過(guò)細菌裂解液于50ml試管中

   在靜置的10分鐘里不要攪動(dòng)濾筒內的裂解液。析出物會(huì )慢慢上浮于上層。如果過(guò)了10分鐘析出物未浮在上層，可用消毒的移液器槍尖驅趕濾筒壁上的析出物。

   取120ul過(guò)濾后裂解液樣本(Sample1)用于實(shí)驗后分析膠，確定生長(cháng)和裂解條件是否最佳。

6.加2.5ml Buffer ER 到過(guò)濾好的裂解液中，翻轉約10次使其混合，冰浴30min

C.結合、洗滌和抽提質(zhì)粒DNA bind,wash & elute plasmid DNA

7.用10ml Buffer QBT 平衡equilibrate QIAGEN-tip 500，并保持重力流動(dòng)gravity flow排空柱筒empty column

8.使用第6步驟得到的過(guò)濾裂解液加入QIAGEN-tip柱中使其重力流動(dòng)通過(guò)樹(shù)脂resin

   取120ul通過(guò)樹(shù)脂后的裂解液樣本(Sample2)用于實(shí)驗后分析膠，確定質(zhì)粒DNA結合于樹(shù)脂的效率。

9.2×30ml Buffer QC洗滌QIAGEN-tip

   第一步洗滌質(zhì)粒準備過(guò)程中大多數污染物，第二步洗滌特別針對培養液過(guò)多或所用菌種含糖量較多的情況。

   取240ul洗滌液樣本(Sample3)用于實(shí)驗后分析膠

   注意：以下步驟均為無(wú)內毒素操作，需使用無(wú)內毒素的聚丙烯塑料管或預處理的玻璃器皿(消毒后180攝氏度烘箱過(guò)夜)

10.15ml buffer QN 抽提DNA

   用30ml的無(wú)內毒素管子收集。如果質(zhì)粒DNA大于45-50kb，將抽提緩沖液QN 65攝氏度預熱后使用會(huì )提高產(chǎn)量

   取60ul洗提樣本(Sample4)用于實(shí)驗后分析膠

   可將洗提液存于4攝氏度保存以暫停實(shí)驗，但時(shí)間不宜過(guò)夜。

D.沉淀、洗滌和再溶解質(zhì)粒DNA precipitate,wash & redissolve plasmid DNA

11.加入10.5ml室溫異丙醇(isopropanol)到抽提的DNA中并混合。4攝氏度冰凍離心機>=15,000×g，30min離心，小心的去上清dacant the supernatant

    盡管離心在4攝氏度離心機下以防止樣本過(guò)熱，但所有溶液須為室溫以減少鹽沉淀。離心前可在離心管上標記以明確離心后DNA斑塊的位置。

12.用5ml 70％室溫的去內毒素乙醇(去內毒素水中加入40ml 96-100％乙醇)洗滌DNA沉淀，>=15,000×g，10min離心。小心去上清避免擾動(dòng)沉淀

13.空氣中干燥air-dry沉淀5-10min，重新溶解DNA到適量的去內毒素的 Buffer TE 中。

    沖洗管壁以完全重新溶解所有DNA(特別是用玻璃管的話(huà))。但不要用移液器吹打以免剪切DNA。過(guò)于干燥的DNA斑塊很難重新溶解。酸性環(huán)境有助于DNA溶解。

E.產(chǎn)量測定

14.260nm紫外分光光度計：A₂₆₀ 0.1-1.0之間

    瓊脂糖凝膠電泳

15.如果產(chǎn)量很低則將前述Sample用于電泳分析問(wèn)題所在。