黃熱病毒抗原（YFV-Ag）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說(shuō)明書(shū)

本試劑僅供研究使用      目的：本試劑盒用于檢測人血清，血漿及相關(guān)液體樣本中黃熱病毒抗原（YFV-Ag）水平。

實(shí)驗原理：

 本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定標本中人黃熱病毒抗原（YFV-Ag）。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，可與樣品中黃熱病毒抗原（YFV-Ag）相結合，經(jīng)洗滌除去未結合的抗體和其他成分后再與HRP標記的抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。用酶標儀在450nm波長(cháng)下測定吸光度（OD值），與CUTOFF值相比較，從而判定標本中人黃熱病毒抗原（YFV-Ag）的存在與否。

試劑盒組成：

試劑盒組成	96孔配置	保存
說(shuō)明書(shū)	1份
封板膜	2片（96）
密封袋	1個(gè)
酶標包被板	1×96	2-8℃保存
陰性對照	0.5ml×1瓶	2-8℃保存
陽(yáng)性對照	0.5ml×1瓶	2-8℃保存
酶標試劑	6 ml×1瓶	2-8℃保存
樣品稀釋液	6 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑A液	6 ml×1瓶	2-8℃保存
顯色劑B液	6 ml×1瓶	2-8℃保存
終止液	6ml×1瓶	2-8℃保存
濃縮洗滌液	（20ml×30倍）×1瓶	2-8℃保存

樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過(guò)程中如出現沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。

4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬(wàn)/ml左右。通過(guò)反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過(guò)程中如有沉淀形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱(chēng)取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻進(jìn)行，提取后應盡快進(jìn)行實(shí)驗。若不能馬上進(jìn)行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟：

1.         編號：將樣品對應微孔按序編號，每板應設陰性對照2孔、陽(yáng)性對照2孔、空白對照1孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）

2.         加樣：分別在陰、陽(yáng)性對照孔中加入陰性對照、陽(yáng)性對照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，

3.         溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。  

4.         配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用

5.         洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿(mǎn)洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

6.         加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7.         溫育：操作同3。

8.         洗滌：操作同5。

9.         顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘

10.     終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時(shí)藍色立轉黃色）。

11.     測定：以空白空調零，450nm波長(cháng)依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應在加終止液后15分鐘以?xún)冗M(jìn)行。

結果判定：

  試驗有效性：陽(yáng)性對照孔平均值≥1.00; 陰性對照平均值≤0.10

 臨界值（CUT OFF）計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15

 陰性判定：樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為人黃熱病毒抗原（YFV-Ag）陰性

 陽(yáng)性判定：樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為人黃熱病毒抗原（YFV-Ag）陽(yáng)性

注意事項

1．操作嚴格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，本試劑不同批號組分不得混用。

2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開(kāi)封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

3．濃洗滌液可能會(huì )有結晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結果。

4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

5．底物請避光保存。

6．試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準，使用雙波長(cháng)檢測時(shí)，參考波長(cháng)為630nm

7．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。終止液為2M的硫酸，使用時(shí)必須注意安全。

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：；2-8℃。