FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系，具有以下優(yōu)點(diǎn)

1、熒光試劑和探針經(jīng)濟、安全；

2、探針?lè )€定，一次標記后可在兩年內使用；

3、實(shí)驗周期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準確；

4、FISH可定位長(cháng)度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當；

5、多色FISH通過(guò)在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測多種序列；

6、既可以在玻片上顯示中期染色體數量或結構的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。

　　FISH技術(shù)是一種非放射性分子遺傳學(xué)實(shí)驗技術(shù)，其基本原理是將直接與熒光素結合的寡聚核苷酸探針或采用間接法用生物素、地高辛等標記的寡聚核苷酸探針與變性后的染色體、細胞或組織中的核酸按照堿基互補配對原則進(jìn)行雜交，經(jīng)變性—退火—復性—洗滌后即可形成靶DNA 與核酸探針的雜交體，直接檢測或通過(guò)免疫熒光系統檢測，最后在熒光顯微鏡下顯影，即可對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析。
　　FISH技術(shù)有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢：

① 安全、快速、靈敏度高；

② 探針能較長(cháng)時(shí)間保存；

③ 多色標記，簡(jiǎn)單直觀(guān)；

④ 可用于中期染色體及間期細胞的分析；

熒光原位雜交技術(shù)問(wèn)世于70年代后期，其曾多用于染色體異常的研究，近年來(lái)隨著(zhù)FISH所應用的探針鐘類(lèi)的不斷增多，特別是全Cosmid探針及染色體原位抑制雜交技術(shù)的出現，使FISH技術(shù)不僅在細胞遺傳學(xué)方面，而且還廣泛應用于腫瘤學(xué)研究，如基因診斷基因定位等 。原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著(zhù)較多缺點(diǎn)，諸如每次檢驗均 需重新標記探針，已標記的探針表現出明顯的不穩定性，需要較和時(shí)間的曝光時(shí)間和對環(huán)境的污染等。在觀(guān)察結果時(shí)，需要較多的分裂進(jìn)行統計學(xué)分析。此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計數上的誤差等。與之比FISH則具有：

①操作操作簡(jiǎn)便，探針標記后穩定，一次標記后可使用二年；

②方法敏感，能迅速得到結果；

③在同一標本上，可同時(shí)檢測幾種不同探針；

④不僅可用于分裂期細胞染色體數量或結構變化的研究，而且還可用于間期細胞的染色體數量及基因改變的研究等特點(diǎn)。

熒光原位雜交技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是:如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經(jīng)變性-退火-復性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進(jìn)行定性、定量或相對定位分析。

FISH選用的標本可以是分裂期細胞染色體也可以是間期細胞．間期細胞可以是冰凍切片，也可以是細胞滴片或印片。生物素（Biotin），地高辛（digoxigenin），dinitrophenyl（DNP），aminoacetyl fluorine（AAF）等均可用于探針標記。前兩者較為常用，通常采用切口平移法（Nick translation）或隨機引物法（Random Primer）對探針標記。在已知探針DNA結構及序列情況下也可采用PCR或RNA逆轉錄法標探針。通常 用于Biotin 標記的探針應大于1000bp以下的探針，不易標記成功。對PCR技術(shù)來(lái)標記。近年來(lái)，Vysis 公司成功的生產(chǎn)些大片段的DNA探針（100-400kb）。由于控針較長(cháng)故可將熒光物質(zhì)直接標記在核苷酸上，這不僅使雜交過(guò)程進(jìn)一步簡(jiǎn)化，而且雜交信號更強。如探針是具有重復序列的DNA或粘粒、YAC探針，在雜交液中加上用超聲斷碎的人體胎盤(pán)組織DNA或Cot DNA,以陰斷探針和染色質(zhì)之間非特異性的結合。

熒光信號在高壓汞燈產(chǎn)生的短波激發(fā)光下常引起熒光信號淬滅的發(fā)生，可將DAPI或PI稀釋于P-phenlenediomine的甘油緩沖液中。任何熒光顯微鏡均可用于觀(guān)察FISH信號，但對單拷貝探針的信號需要質(zhì)量較好的熒光顯微鏡。如采用雙色或多色濾光片可以同時(shí)觀(guān)察FITC、Texas-Red等多種顏色的FISH信號，不論是染色體還是單拷貝基因的FISH信號均可用高度敏感和高分辨率的彩色膠片攝取，也可通過(guò)CCD（charge coupled device）的照相系統或Laser Scanning Confocal Imaging System（激光掃描共焦成像系統）將攝取的信號儲存在計算機內，經(jīng)軟件處理后，將信事情顯示在熒光屏上。由于有多種方法標記DNA探針，故一次雜交可以同時(shí) 觀(guān)察多個(gè)探針的信號，如兩個(gè)不同的探針?lè )謩e用Biotin和Digoxigenin標記，雜交后用avidin-FITC和抗-Dig-Texas-Red分別與探針上的Biotin 和Digoxigenin結合，應用雙色濾光片，在顯微鏡下就可以同時(shí)看見(jiàn)帶有綠色熒光的FITC和紅色熒光的Texas-Red信號。同理，采用三種或三種以上不同的半抗原，如Biotin,DIG和DNP等標記探針，然后用多種不同顏色的熒光素，如FITC（綠色），Rhodamine（紅色），AMA或Cascade Blue（藍色）等結合抗體進(jìn)行檢測，可同時(shí)得到多種不同顏色的熒光信號，如采用不同的排列組合，最多可同時(shí)檢測7種不同的探針。由于常規的熒光顯微鏡的照像系統，彩色膠片不易多次曝光，限制了這種聯(lián)合標探針的應用，使用Digital Imaging Camera System或CCD照像系統，先分別多次攝取灰色的影像關(guān)儲存在計算機內，而后冠以人為的顏色，運用軟件系統事例各次得到的影像，最終形成一個(gè)復合的多顏色的圖像。

此外，對已做過(guò)G顯帶的染色體片子用75%酒精或甲醇褪色后，可再做FISH這樣可更清晰的辨認各條染體及染色色體結構異常（包括某些復雜的易位，插入，倒位等）FISH和G顯帶技術(shù)結合不僅可以用新近G帶處理過(guò)的片子，而且還可用陳舊的G帶片子。因此，FISH技術(shù)可成功的幫助細胞遺傳學(xué)家做出回顧性分析。

FISH技術(shù)和RFLP（Restrict Fragment Lenth Polymorphysim）結合，可以更精確地描述原必于染色體長(cháng)短臂等結構改變和染色體梳型或復制片段的性質(zhì)。FISH和細胞免疫化這技術(shù)結合，可以同時(shí)用多種顏色反應檢測不同的核苷酸鏈和蛋白質(zhì)，這樣可以在單個(gè)細胞內同時(shí)找到基因的位點(diǎn)，轉錄和翻譯和產(chǎn)物，有助于對核甙酸結構與功能以及基因表達產(chǎn)物之間關(guān)系的研究。在基因圖譜繪制中，FISH和Linkage mapping結合起來(lái)，即使對具有高度多形態(tài)的基因位點(diǎn)也能較精確地定下來(lái)。

在細胞遺傳學(xué)檢查中，重復序列的探針應用最多，它們是α衛星DNA、β-衛星DNA和經(jīng)典衛星DNA探針。α衛星DNA探針主要檢測人染色體的著(zhù)絲粒。β衛星DNA位于頂端著(zhù)絲粒染色體及號染色體的異染色體質(zhì)周?chē)?經(jīng)典衛星DNA（classic-saiellite DNA）有著(zhù)AATGG短片段重復，位于染色體1、9、15、16和Y染色體長(cháng)臂異染色質(zhì)周?chē)?。后兩種探針除去可用于染色體數目檢查外，還可用于上述部位精細改變的檢查。三種探針產(chǎn)生的熒光信號都在染色體著(zhù)絲?；蚋?，因此常用于鑒定，羊水細胞可不培養直接作FISH檢查，發(fā)現在21三體（Down氏綜合征）、18三體（Edward綜合征）、13體（Patau 綜合征）、45XO（Turner氏綜合征）和47XXY（Klinfelter綜合征）。

FISH在白血病方面和應用較為方泛的是慢性粒細胞白血病bcr/abl易位DNA探針，采用Digoxigenin標記于22號染色體上的bcr基因，用Biotin標記位于9號染色體上的Abl基因，然后用紅綠二種不同顏色的熒光素檢測，慢粒常有染色體易位t（9；22）（q34；q11）而引起bcr和Abl基因的融合，這時(shí)不需要檢測分裂中期細胞，在間期細胞中就可以見(jiàn)到二種顏色訊號的混合，從而可以確定是Ph陽(yáng)性細胞。這特別適合化療后緩解的CML，極易發(fā)現殘存的白血病細胞。其它如t（15；17）易位DNA探針，t（18；21）易位DNA探針?lè )謩e可用于急性早幼粒白血?。ˋPL）和急性粒細胞白血?。ˋML）的診斷。此外在白血病的診斷方面，還有等位17號染色體長(cháng)臂iso(17q),16號染色體長(cháng)臂間倒位inv（16）探針等，都有商業(yè)出售。

在實(shí)體腫瘤方面，應用較為廣泛的是HER-2/neu基因探針。乳腺癌細胞中Her/2-neu基因的擴增常預示著(zhù)患者預后較差。在FISH技術(shù)之前的所有測定基因擴增的方法，都是采用經(jīng)典的分子生物學(xué)方法South blotting等），但這些方法與FISH相比，不僅費時(shí)費力，而且也不可能在細胞水平上觀(guān)察到基因擴增的狀態(tài)。FISH技術(shù)的更大優(yōu)點(diǎn)是可以在間期細胞核上觀(guān)察到DNA擴增的直接證據，而且間期細胞核所顯示出的擴增DNA熒光信號其數量多少及熒光強度常與DNA擴增的水平有關(guān)。1998年美國政府FDA批準了作為基因治療的一種單克隆抗體Herceptin，可配合化療來(lái)治療部分晚期轉移性乳腺癌病人，約25-30%的乳腺癌病人有HER-2/neu基因的擴增和/或過(guò)度表達。這部分病人適合Herceptin治療、FDA在此前一些時(shí)候批準了Vysis公司的HER-2/neu基因DNA探針在乳腺癌臨床診斷上的應用。HER-2/neu基因的擴增或過(guò)表達也見(jiàn)于卵巢癌、子宮內膜癌、涎腺腫瘤及胃癌等惡 性腫瘤?？梢灶A，在不久的將來(lái)Herceptin和HER-2/neu基因DNA探針可用于這些腫瘤的治療和診斷。其它一些實(shí)體瘤的腫瘤的腫瘤基因的探針如N-myc,C-myc,CyclinD1等雖有商業(yè)出售，但目前還未用于臨床。

染色體x,y,21,18和13的數量變化常與先天性疾病有關(guān)。采用染色體著(zhù)絲粒重復序列DNA作為探針，可以確定分裂細胞或間期細胞這些染色體的數目止，如采用21號染色體的涂抹（painting）探針，根據標記區域的大小可檢測出Down氏綜合征的發(fā)生。

實(shí)體腫瘤的染色體研究比較困難，這是由于獲取足夠量的分裂期腫瘤細胞比較困難。使用染色體著(zhù)絲特異探針，對間期細胞進(jìn)行染色體數量變異分析，可獲得較好的結果。因此FISH技術(shù)十分有助于腫瘤細胞遺傳細胞遺傳學(xué)的研究。Hopman采用FISH技術(shù)研究膀胱癌，發(fā)現9號染色體的丟失。FISH檢測的結果與流式細胞儀分析的結果完全一致。Waldman等發(fā)現染色體數目的改變和腫瘤的分化及分期有著(zhù)密切關(guān)系，如7號染色體嗇常見(jiàn)于有較高的Brdard分級和有較高的PCNA標記指數的晚期、惡性度高的腫瘤。Waldman認為這一現象可涉及到7號染色體上某些特殊基因的表達增加或被抑制。采用多種染色體探針，以不同的顏色標記，更適合于實(shí)體腫瘤染色體數目改變的異質(zhì)性研究。

對于G或Q顯帶難以確定的染色體結構改變，運用FISH技術(shù)可以幫助解決。許多不能歸類(lèi)的標記染色體，FISH技術(shù)可以確定畸變的來(lái)源，如Miura等報告21例非小細胞肺癌（NSCLC）的染色體改變，其中一例有2個(gè)標記染色體，用FISH檢測后證實(shí)是來(lái)自9號染色體的短臂梁色體上微細帶的丟失，普通顯帶常不易發(fā)現，用特定的基因探針檢測時(shí)，在正常應該有熒光信號的部位如不出現信號，表示有染色體的丟失。Lux等用Ankyrin基因作探針，檢測遺傳性球殂紅細胞增多癥病人的染色體和間期細胞，發(fā)現有這個(gè)基因的缺失。Taguchi等采用靠近3p21帶附近的6個(gè)不同位點(diǎn)的探會(huì )，比較異常和正常3號染色體，確定胸膜間皮瘤有3p21帶的缺失并推測這個(gè)區域可能存在重要的抑癌基因，為了進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究提供了重要線(xiàn)索。選擇按一定順序排列的基因探針，可以幫助確定染色體倒位，尤其是臂間倒位的性質(zhì)，如急性白血病有16號染色體的倒位，選擇兩個(gè)分別位于斷裂點(diǎn)近端和遠端的粘粒探針，同時(shí)用16號染色體著(zhù)絲位探針，正常細胞熒光信號的次序是：粘粒-粘粒-著(zhù)絲粒，而白血病細胞的信號的次改變?yōu)檎沉?著(zhù)絲粒-粘粒。

雜交細胞通常是含有單個(gè)人類(lèi)染色體嚙齒動(dòng)物細胞。這種雜交細胞常用于繪制基因圖譜或生產(chǎn)單個(gè)染色體特DNA庫。雜交細胞在培養過(guò)程中，人體染色體極易丟失或發(fā)生染色體重排，因此，需要對雜交細胞定期進(jìn)行細胞遺傳學(xué)檢查，采用人體組DNA作為探針或相應人體染色體涂抹探針，可以很主便的檢測這些改變。

采用FISH技術(shù)，不僅可以直接確定某一DNA鏈在染色體上的位置，而且誚用多種顏色熒光素的標記控針，還提供了一個(gè)簡(jiǎn)單的確定基因順序的方法?？捎貌煌伾珶晒馑貥擞泝蓚€(gè)不同的DNA鏈，而且他們在染色體上的距離大于1Mbp時(shí)，可以依據不同探針信號的排列關(guān)系分辨他們在染色體上的順序。采用5-Burd處理的細胞，可以獲得高分辨顯帶的染色體，從而增加DNA鏈標記到染色體上的分辨能力。如果使用間期細胞，兩個(gè)DNA鏈的距離可以縮短至50Kbp，這個(gè)間距是染色體上的分辨距離的二十分之一。不同探針的次序可以通過(guò)測量其間期細胞的距離來(lái)確定。

確定DNA鏈在染色體上精細位置，適用于檢查某些特殊的染色體易位和缺失，如涉及11號染色體q23的易位常見(jiàn)于急性白血t（4；11）見(jiàn)于急性淋巴細胞白血?。ˋLL），t（6；11)，5（9；11）見(jiàn)于急性粒細胞白血?。ˋML），t（11；19）見(jiàn)于急淋和急粒兩種白血病。

標記同一DNA鏈與不同種必細胞的染色體雜交，可以找出不同種屬之間的同源基因以及基因在染色休上的位置，從而了解種屬之間的進(jìn)化關(guān)系。

DNA擴增通常表現為異常的顯帶區域（ABRS）或異染質(zhì)區（HSRS）以及無(wú)著(zhù)絲微小體（DM），這些基因擴增的細胞遺傳學(xué)表現在許多惡性腫瘤中。搞清楚腫瘤細胞中物定DNA鏈（基因）的擴增，有助于了解腫瘤的惡性增生過(guò)程。在腫留細胞中某些腫瘤因(Oncogene)的擴增，可作為預測腫瘤進(jìn)展及預后的臨床指征。如FISH能有效地在染色體上定位擴增的特定DNA，特別是當細胞遺傳學(xué)發(fā)現在HSR或ABRS來(lái)源及位置，推測可能擴增的腫瘤基因，從而有目的檢測某些基因，并能很快得到直接清晰的基因擴增的信息。Cherif等在結腸腺癌細胞中，采用FISH技術(shù)發(fā)現C-myc的擴增，而且C-myc擴增鏈是重排在19號染色體的長(cháng)臂上。染色體上策細帶的丟失，普通顯帶不易發(fā)現，用特定的基因探針檢測時(shí)，在正常應該有熒光信號的部位如不出現信號，表示有染色體的丟失。用Ankyrin基因作探會(huì )，檢測遺傳性球殂紅細胞增多癥病人的染色體和間期細胞，發(fā)現有這個(gè)基因的缺失。有學(xué)者用FISH技術(shù)在37例B細胞淋巴瘤中發(fā)現21例（56.8%）存在6q23-24的缺失，故認為這一改變對淋巴瘤診斷有實(shí)際應用值。