作者：鄧淑珍，張海林，李金梅    作者單位：1.大理學(xué)院公共衛生學(xué)院，云南 大理 671000； 2.云南省地方病防治所/云南省病毒立克次體研究中心，云南 大理 671000. 

【摘要】  　　流行性乙型腦炎病死率較高，后遺癥嚴重，在亞洲地區危害較大。本文就乙腦病毒的分類(lèi)、抗原特性、對細胞和動(dòng)物敏感性、基因組的結構特征、毒力基因、基因分型和疫苗等方面的研究進(jìn)展作一綜述。

【關(guān)鍵詞】  流行性乙型腦炎病毒；生物學(xué)特性；分子特征；疫苗

　　流行性乙型腦炎（簡(jiǎn)稱(chēng)乙腦）國際上稱(chēng)為日本腦炎（Japanese encephalitis）。本病是由日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus）經(jīng)蚊蟲(chóng)媒介叮咬傳播而引起的一種中樞神經(jīng)系統感染的急性傳染病，也是一種人獸共患的自然疫源性疾病。臨床上以高熱、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭及腦膜刺激征為特征。病死率較高，而且后遺癥嚴重。本病對人類(lèi)健康危害較大，現就乙腦的病原學(xué)研究進(jìn)展綜述如下。

　　1 乙腦病毒分類(lèi)及抗原特性

    乙腦病毒在分類(lèi)上屬于黃病毒科（F1aviviridae）黃病毒屬（F1avivirus）成員。在黃病毒屬中按抗原組劃分，乙腦病毒抗原組包括乙腦、西尼羅和圣路易腦炎病毒。黃病毒成員之間存在著(zhù)不同程度的血清學(xué)抗體交叉反應，而抗原組內不同病毒之間交叉反應更為嚴重，因此在血清學(xué)檢測和判定時(shí)要充分考慮相關(guān)病毒交叉的可能［1,2］。

　　2 乙腦病毒對細胞和動(dòng)物敏感性

    乙腦病毒能在BHK21、Vero、LLC-MK、C6/36等傳代細胞或猴腎、地鼠腎、雞胚纖維母細胞和豬腎等原代細胞中增殖，并產(chǎn)生細胞病變效應(CPE)。細胞感染病毒后第3～5d開(kāi)始出現CPE，病變的特點(diǎn)是單層細胞出現變圓、脫落及破裂，在C6/36細胞上可出現細胞融合形成空泡。C6/36細胞是乙腦病毒最為敏感的細胞，已廣泛應用于乙腦病毒的分離和有關(guān)研究中。乙腦病毒能在BHK21、LLC-MK2和Vero等細胞上產(chǎn)生蝕斑。乙腦病毒腦內接種乳小白鼠較為敏感，乳鼠可出現以馳緩性麻痹為主的腦炎癥狀而死亡。潛伏期3～4d。主要癥狀是行動(dòng)遲緩、離群、聳毛、尾強直、抽搐、四肢麻痹，最終死亡。該病毒也能引起幼年小白鼠（8～10g）或成年鼠發(fā)病死亡。

　　3 乙腦病毒基因組的結構特征

    乙腦病毒基因組為單股正鏈RNA，全長(cháng)約11kb，乙腦病毒各地代表株的全核苷酸序列均有發(fā)表。乙腦病毒的基因結構為5’端有95個(gè)核苷酸的非編碼區接著(zhù)一段10 296個(gè)核苷酸的編碼區，隨后是585個(gè)核苷酸的3’ 端的非編碼區。乙腦病毒的基因組只有一個(gè)開(kāi)放讀碼框，其編碼是由3個(gè)432個(gè)氨基酸組成的多聚蛋白前體，該多聚蛋白前體在宿主細胞內，在病毒自身編碼的蛋白酶（NS3）及胞內其它酶類(lèi)作用下，形成3個(gè)結構蛋白（C，PrM和E）和7個(gè)非結構蛋白（NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5），基因順序為：5’cap-NCR-C-PrM-M-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3’NCR（cap：帽狀結構，NCR：非編碼區，C：核衣殼蛋白，PrM：前膜蛋白，M：膜蛋白，E：包膜糖蛋白；NS：非結構蛋白）［3,4］。PrM、E和NS1糖基化，均有免疫保護作用。prM蛋白是未成熟病毒體的一部分，在病毒感染后期，它可以誘導保護性免疫，E蛋白基因大小為1 500 bp，編碼500個(gè)氨基酸殘基，囊膜糖蛋白E是主要的毒力抗原，E蛋白上有特異性抗體的中和表位，可誘導免疫動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體。NS1是糖基化蛋白，為乙腦病毒的保護性抗原，而NS1蛋白為可溶性補體固定原。

　　4 乙腦病毒毒力基因

    已發(fā)現影響乙腦病毒毒力的相關(guān)因素很多, 如病毒與細胞受體結合的能力、病毒與細胞融合的速率、病毒RNA 合成酶的合成速率等,都會(huì )不同程度地影響該病毒的毒力。通過(guò)對減毒株和野毒株的比較研究發(fā)現影響乙腦病毒毒力的7個(gè)共有氨基酸突變位點(diǎn)，即E138（Glu-Lys）、E176(Ile-Val)、E315(Ala-Val)、E439(Lys-Arg)、Ns2-63（Glu-Asp）、NS3-105((Ala-Gly)、NS4B(Ile- Val),其中有4個(gè)位點(diǎn)集中在E基因區，其余變異位點(diǎn)分布在非結構基因，表明影響毒力的因素不僅限于 E基因。其它一些突變位點(diǎn)屬于非共同的氨基酸突變位點(diǎn)，分別分布在結構基因和非結構基因部位，但這些非共同的氨基酸突變位點(diǎn)是否對乙腦病毒毒力有影響尚需進(jìn)一步研究［5,6］。
　　Sumiyoshi等的研究也證明，E蛋白在乙腦病毒毒力中占有重要位置，E基因的單點(diǎn)突變即可使乙腦病毒喪失其神經(jīng)毒力/侵襲力［7］。進(jìn)一步的研究發(fā)現，SA14-14-2減毒株與其母株SA14野毒株的E區比較共有8個(gè)氨基酸殘基差異，具體位置在E107、E138、E176、E177、E264、E279、E315和E439位，是毒力減弱的關(guān)鍵氨基酸殘基位點(diǎn)［6,8］。還發(fā)現AT31和AT222E蛋白上E138和E176位點(diǎn)氨基酸變化可能改變了E蛋白對細胞受體的吸附性，或者引起該病毒對其他細胞不可穿透，導致病毒毒力減弱，E138和E176一起對乙腦病毒強毒株在連續性傳代過(guò)程中毒力減弱起了關(guān)鍵作用，這2個(gè)位點(diǎn)上的氨基酸是決定乙腦病毒病原性的關(guān)鍵氨基酸，與乙腦病毒神經(jīng)毒力密切相關(guān)［9］。因此，利用E蛋白這一分子生物學(xué)特性，以開(kāi)發(fā)更有效，更廉價(jià)的乙腦疫苗［10,11］。

　　5 乙腦病毒基因分型

    首先由Takegami（1982）將乙腦病毒分為 3 個(gè)血清型（Ja Gar、 Nakayama 和 Mie型）。進(jìn)一步的研究，依據交叉中和試驗，RNA 寡核苷酸指紋圖譜、基因序列以及單克隆抗體的交叉反應性,可將乙腦病毒分為5 抗原組，即Nakayama2RFVL(分離自日本東京)、Kamiyama(分離自日本福岡)、691004(分離自斯里蘭卡)、Beijing21(分離自中國) 和 Muar (分離自新加坡)。近幾年，普遍采用Chen等建立的基因分型法對乙腦病毒進(jìn)行分型［12,13］。根據核酸序列的同源性，Chen等將乙腦病毒基因分型的cut-off值定為12%的差異度，從而得到進(jìn)化關(guān)系上較為明顯的4個(gè)型：泰國北部及柬埔寨地區分離的毒株屬于基因Ⅰ型；來(lái)自泰國南部、馬來(lái)西亞、印度尼西亞的毒株形成基因Ⅱ型；來(lái)自日本、中國等地區的毒株屬于基因Ⅲ型；部分印度尼西亞的毒株獨自形成了基因IV型［14］。有研究發(fā)現同一基因型的毒株在地域上有更為緊密的聯(lián)系，即有明顯的地域性，在同一地區分離的毒株即使年代相差很遠也屬于同一基因型。但是近十多年來(lái)，乙腦病毒基因型的分布地區有了新的變化；中國大陸、韓國和日本已經(jīng)報道發(fā)現基因Ⅰ型乙腦病毒［15,16］；1995年澳大利亞首次出現乙腦病例，其后分離的毒株分別屬于基因Ⅰ型和Ⅱ型［17］。近幾年，我國對不同來(lái)源的乙腦病毒進(jìn)行了基因分型［16,18～21］，發(fā)現分離自我國的乙腦病毒絕大多數是Ⅲ型，并廣泛分布于各地乙腦疫區。也證實(shí)我國有1型乙腦病毒的分布，最早分離到1型病毒的時(shí)間為1977年，認為1型病毒可能是輸入的。最近分離到的乙腦病毒大多為Ⅲ型，還從上海、遼寧和云南分離到1型病毒。臺灣對不同來(lái)源的47株病毒進(jìn)行研究，可分為1、2和3群（型）［22］。乙腦病毒4個(gè)型之間具有較強的交叉保護作用，在血清學(xué)和免疫學(xué)試驗中也有較強的交叉反應，用血清學(xué)試驗難以區分乙腦病毒的型別。

　　6 乙腦實(shí)驗診斷技術(shù)

    乙腦病毒抗體檢測方法較多，如血凝抑制、補體結合、中和、間接血凝抑制、乳膠凝集、酶聯(lián)免疫和免疫熒光試驗等。其中酶聯(lián)免疫試驗檢查IgM和IgG抗體是目前用于病人診斷較為常見(jiàn)的方法，由于乙腦病毒與其它黃病毒有交叉反應，近年來(lái)由于采用乙腦病毒特異性蛋白制備抗原［23］，該法的特異性和敏感性均有較大提高。其它方法主要用于流行病學(xué)調查和實(shí)驗研究中。病毒分離仍然使用細胞或小鼠法，由于分子生物學(xué)方法的發(fā)展和逐漸普及，病毒檢測更為簡(jiǎn)便和快速，培養物經(jīng)過(guò)血清學(xué)方法初步判定后，用RT-PCR法檢測乙腦病毒核酸即可作出準確鑒定，通過(guò)序列測定分析可確定分離株的分子遺傳特征。實(shí)時(shí)熒光PCR和基因芯片技術(shù)的發(fā)展，為乙腦的診斷提供了更好的方法［24］。

　　7 乙腦疫苗及其應用

    控制乙腦流行的方法主要是滅蚊和疫苗接種。在蚊蟲(chóng)控制措施難以全面落實(shí)的情況下，疫苗接種成為控制乙腦流行最為有效的方法。目前，國內外應用的乙腦疫苗主要有滅活疫苗和減毒活疫苗兩種。滅活疫苗主要是鼠腦純化滅活疫苗和地鼠腎細胞滅活疫苗。鼠腦純化滅活疫苗是從感染鼠腦培養制備的，由日本研制生產(chǎn)并得到國際廣泛認可和使用的疫苗；地鼠腎細胞滅活疫苗為我國生產(chǎn)，病毒經(jīng)原代地鼠腎細胞培養制備的疫苗，1998年開(kāi)始生產(chǎn)使用，隨后在全國大面積使用。近幾年，Vero細胞純化滅活疫苗已在研究生產(chǎn)，該疫苗為新一代的乙腦滅活疫苗，有較好的發(fā)展前景。減毒活疫苗主要是我國自主研制的乙腦SA14-14-2株，為目前唯一獲得認可和推廣使用的乙腦活疫苗，自1989年獲得新藥證書(shū)以來(lái)，該疫苗產(chǎn)量不斷增多，并在全國廣泛使用已達3億多人份，該疫苗具有接種針次少、副反應小、免疫原性高、免疫效果好等優(yōu)點(diǎn)而在國內得到廣泛應用并出口到韓國、尼泊爾和印度等亞洲國家使用［25,26］。然而，由于接種減毒活疫苗后，可在人體內產(chǎn)生感染過(guò)程和出現病毒血癥，該疫苗病毒能否通過(guò)媒介蚊蟲(chóng)叮吸接種疫苗者的血液將病毒傳播給健康人而引起疾病，尤其是SA14-14-2病毒通過(guò)蚊蟲(chóng)增殖后其弱毒特性和基因型特征能否發(fā)生回復突變，毒力增強而發(fā)生病毒生態(tài)學(xué)改變等，仍然是世界衛生組織及專(zhuān)家們最擔心和關(guān)注的問(wèn)題。最近，我國學(xué)者對現行使用的減毒活疫苗SA14-14-2病毒進(jìn)行了感染蚊蟲(chóng)實(shí)驗及安全性評價(jià)。研究認為，作為乙腦主要傳播媒介的三帶喙庫蚊和致倦庫蚊對SA14-14-2疫苗株的經(jīng)口感染和病毒在蚊體內的復制嚴重受限［27］，但經(jīng)胸腔接種SA14-14-2株后，病毒能在三帶喙庫蚊和致倦庫蚊體內增殖［28,29］。而對照實(shí)驗表明，這兩種庫蚊無(wú)論經(jīng)口或胸腔接種野毒株均能在蚊體內增殖，且蚊體內病毒滴度較高。說(shuō)明減毒疫苗病毒已不具有在蚊蟲(chóng)中腸細胞增殖的特性，即使蚊蟲(chóng)按自然途徑（經(jīng)口）叮吸接種過(guò)乙腦減毒活疫苗SA14-14-2病毒的人或動(dòng)物血液后，疫苗病毒也不會(huì )在蚊體內感染增殖，更不會(huì )引起疫苗病毒的傳播［27～29］，并以此推論媒介庫蚊叮吸被該活疫苗免疫的宿主動(dòng)物和人后，不會(huì )引起感染和傳播。雖然經(jīng)非自然途徑（胸腔接種），該疫苗病毒可在蚊體內感染復制，但經(jīng)蚊體內增殖后的疫苗病毒的弱毒特性未發(fā)生改變，并通過(guò)對該病毒E區的比較分析，獲得了SA14-14-2減毒株弱毒特性保持穩定的分子基礎，完全符合現行國家藥典的規定［30］。該研究首次證實(shí)我國自行開(kāi)發(fā)的乙腦減毒活疫苗的應用不會(huì )引起該病毒的生態(tài)學(xué)改變，廣泛使用該疫苗是安全的，對該疫苗安全性的證實(shí)將促進(jìn)該疫苗在全世界的推廣和使用。
　　基因工程疫苗是乙腦疫苗發(fā)展的方向，國內外學(xué)者在嵌合病毒疫苗、DNA疫苗、蛋白質(zhì)疫苗和亞病毒顆粒疫苗方面取得了一些進(jìn)展。如用乙腦SA14-14-2病毒的PrM和包膜E蛋白基因代替17D黃熱病毒cDNA的相應序列，構建了嵌合的減毒乙腦疫苗，免疫鼠和猴子具有安全性、免疫原性和保護作用［30］。用表達的乙腦病毒E蛋白（或含Prm和E 基因；Prm、E、NS1和NS2基因）的重組痘苗病毒免疫小鼠能誘導產(chǎn)生中和抗體及抗乙腦病毒攻擊［32］。DNA疫苗研究用構建編碼乙腦病毒E蛋白的DNA質(zhì)粒接種小鼠，對攻擊感染有一定保護作用，但免疫鼠中未能檢出乙腦病毒抗體，而產(chǎn)生了低水平的乙腦病毒特異性T細胞增殖，認為保護作用可能主要與細胞免疫有關(guān)［33,34］。另外的研究用構建的含乙腦病毒Prm和E基因的質(zhì)粒免疫鼠，能產(chǎn)生較高水平的特異性中和抗體，并對乙腦病毒攻擊感染產(chǎn)生完全的保護，免疫豬能產(chǎn)生記憶B細胞和持續產(chǎn)生中和抗體，認為該疫苗可作為第二代乙腦候選疫苗［32,35～37］。有的學(xué)者用乙腦病毒NS1基因的質(zhì)粒免疫小鼠，對乙腦病毒攻擊產(chǎn)生保護性免疫［38］。用乙腦病毒Prm和E蛋白組成的細胞外顆粒（EPs）免疫小鼠能產(chǎn)生特異的中和抗體和T淋巴細胞［39］。雖然基因工程疫苗有良好的發(fā)展前景，但在臨床使用前尚有很多問(wèn)題需要解決。

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