一、菌落PCR法快速鑒定陽(yáng)性克隆

1、菌落PCR引物的設計

    ①、為了最大程度避免菌落PCR出現假陽(yáng)性結果，原則上應將引物的一端設計在載體上，另一端設計在插入片段上，長(cháng)度25堿基足矣；

    ②、為減少非特異性片段的產(chǎn)生，同時(shí)保證兩步法能夠有效擴增出目的片段，建議將引物的Tm值設計在62-68℃之間；

注：Tm值的計算請采用“最鄰近法”（the nearest neighbor method），該法計算準確度較高，為多種計算機軟件所采用（需要相關(guān)軟件的同學(xué)請到FTP上下載“Molecular.Biology.Insights.Oligo.v7.37.zip”）。金斯瑞引物合成單上的Tm值經(jīng)驗證完全不準，請無(wú)視之！

③、引物設計時(shí)請適當考慮通用性，如插入片段為RxR，則可將引物設計在DBD區，相比之下，對這一區域做缺失研究的人較少，載體以PGL3系列載體為例，可將引物設計在熒光素酶的基因序列上，保證對PGL3-Basic、Promoter和Enhancer均有效；

④、目的片段長(cháng)度在500 bp以上較為合適，一方面可以檢測兩段引物之間的序列是否出現缺失或插入，另一方面跑膠時(shí)條帶也比較明顯（堿基數越多則結合的染料越多）。

 

2、菌落PCR步驟

①、牙簽挑取單菌落后，浸泡于200 μL無(wú)抗LB培養基中，旋渦混勻5-10 s，使菌體在培養基中均勻分布；

注：挑選單菌落時(shí)請挑個(gè)頭中等，不大不小的菌落，這樣的菌落呈陽(yáng)性的概率較高。一般情況下，含有空載體的菌生長(cháng)較快，故菌落大，不宜挑取，菌落太小則無(wú)法區分是空載體菌落還是還有目的片段的菌落，亦不可取。此為經(jīng)驗之談，具體原因不明。

②、吸取1 μL菌液作為模板，進(jìn)行15 μL體系的兩步法PCR（68℃延伸，98℃解鏈），剩余菌液4℃存放備用；

注：預變性（94℃）時(shí)間應延長(cháng)至10 min，使菌體破裂。目標片段為1000 bp左右時(shí)，20循環(huán)已足夠，若目標片段為500 bp左右，則建議進(jìn)行25循環(huán)。菌液（尤其是DH5α）在接種前不可進(jìn)行振蕩培養，否則容易導致小搖失?。ú婚L(cháng)菌），經(jīng)驗之談，原因不明。

③、PCR產(chǎn)物鑒定：方法一（推薦）：取PCR產(chǎn)物（10 μL左右），加Loading Buffer后跑膠鑒定，凡沒(méi)有特異性條帶或泳道中明顯的條帶不止1條的，均可判定為陰性菌落，棄之。方法二（不太推薦，趕時(shí)間的話(huà)可以試試）：在PCR產(chǎn)物（10 μL左右）中直接加入用TAE按1/10稀釋后的“UltraPower”熒光染料1 μL，混勻后等待30 s，之后于365 nm紫外燈下觀(guān)察顏色變化，溶液呈濃綠色的可認定為陽(yáng)性菌落（即PCR能夠擴增出產(chǎn)物，但是不是特異不好說(shuō)，根據以往經(jīng)驗，該法產(chǎn)生假陽(yáng)性的概率<10%）；

④、將陽(yáng)性菌落所對應的菌液轉接于20 mL含抗培養基中，培養15-16小時(shí)，保種后提取質(zhì)粒（如有必要，可送測序）。

 

二、質(zhì)粒的提取與內毒素的去除

1、小提試劑盒提取質(zhì)粒

①、取菌液16 mL，平均分到4個(gè)離心管，離心后收集菌體，按小提試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，提取質(zhì)粒；

注：16 mL菌液裂解后，以?xún)蓚€(gè)吸附柱吸附即可（理論上可吸附80 μg質(zhì)粒），使用更多的吸附柱不會(huì )提高回收率（經(jīng)驗）。另外，菌液多不代表質(zhì)粒就提得多，16 mL與20 mL，在相同的裂解體系下，其質(zhì)粒提取總量相差不會(huì )超過(guò)10%（經(jīng)驗）。因此，使用過(guò)多的菌液除了增加產(chǎn)物中內毒素的含量外，無(wú)實(shí)際意義。

②、最后一步洗脫時(shí)，建議每個(gè)吸附柱加洗脫液（水或TE）100 μL，洗脫一次后，再將洗脫液吸回吸附柱中，重復洗脫一次，一般情況下可提高洗脫率20%左右，同時(shí)建議暫時(shí)保留吸附柱，待檢測質(zhì)粒含量后再決定是否進(jìn)行第三次重復洗脫。若菌體長(cháng)勢良好，該步驟可獲得質(zhì)粒約60-75 μg。

注：采用更多地洗脫液有助于提高回收率，但過(guò)大的溶液體積將導致后續步驟（異丙醇沉淀DNA）中質(zhì)粒的損失，故建議洗脫液用量為每柱100-125 μL。

 

2、內毒素去除

①、取質(zhì)粒溶液，加入0.125倍體積的3 mol/L乙酸鈉溶液（pH5.0），置于冰上預冷5 min；

②、向預冷的溶液中添加0.125倍體積的去內毒素試劑（Endotoxin-Be-Gone），混勻后在冰上靜置10 min；

③、將溶液轉移到65℃水浴鍋中，放置0.5-1 min，此時(shí)可見(jiàn)溶液變渾濁；

④、取出渾濁液于12000 rpm下離心2 min，轉移上清液；

注：天冷時(shí)，③、④兩步的間隔時(shí)間要短，動(dòng)作要快，否則內毒素去除試劑將無(wú)法通過(guò)離心去除。此外，室溫在25℃以上時(shí)，內毒素去除效果較好，步驟②-④做兩次即可，室溫較低時(shí)，應做三次，以保證內毒素去除率。

 

3、質(zhì)?；厥?/span>

方法一（沉淀法）：

①、內毒素去除后，加入1倍體積的異丙醇，于12000 rpm離心20 min左右（可在室溫下進(jìn)行）或加入2倍體積的無(wú)水乙醇，于12000 rpm冷凍離心20 min左右，即可在離心管底部看見(jiàn)DNA沉淀；

②、若采用異丙醇沉淀，則用75%乙醇清洗沉淀2次（12000 rpm，離心5 min）除鹽；若采用乙醇沉淀，則清洗1次足夠；

③、棄去上清液，空干乙醇，溶解質(zhì)粒。

 

方法二（吸附法）：

內毒素去除后，加入0.4倍體積的3 mol/L乙酸鈉，取小提柱2根，將溶液均勻添加在吸附柱中，按試劑盒說(shuō)明書(shū)回收質(zhì)粒。

注：兩種方法對質(zhì)粒的回收效果沒(méi)有顯著(zhù)區別（回收率為70%-85%），但相對來(lái)說(shuō)異丙醇沉淀法對操作要求較高，且耗時(shí)較長(cháng)，故建議使用吸附法。

  

廣州健侖生物科技有限公司

徐華

2005/03/28