登革熱?IgM 捕捉ELISA 法（MacELISA）實(shí)驗
發(fā)布時(shí)間：2014-3-8 9:20:13??????瀏覽次數：
登革熱IgM 捕捉ELISA 法（MacELISA）實(shí)驗
陽(yáng)性抗原：采用C6/36 細胞感染登革病毒培養物為陽(yáng)性抗原。
陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36 細胞為陰性抗原對照。
（2）抗人IgM（μ 鏈）單克隆抗體或多克隆抗體；
（3）登革病毒IgM 陽(yáng)性、陰性對照血清；
（4）辣根過(guò)氧化物酶標記登革病毒單克隆抗體；
（5）緩沖液：
洗滌液：pH7.4 PBS－T（0.05％吐溫－20）；
稀釋液：pH7.4 PBS（5％牛血清）；
封閉液：pH9.6 碳酸緩沖液（1％牛血清白蛋白）；
（6）顯色液：A/B 液
（7）終止液：4N H2SO4
（8）酶標板、酶標儀。
檢測步驟：
（1）用稀釋液按效價(jià)稀釋抗人μ 鏈單克隆抗體，100μl/孔，加蓋，4℃過(guò)
夜；
（2）棄去抗人μ 鏈，用洗滌液重復洗3 次，甩干，加封閉液，100μl/孔，
置37℃水浴孵育2 小時(shí)；
（3）棄封閉液，用洗滌液重復洗3 次，甩干。
（4）將待檢血清用稀釋液從1：10 開(kāi)始作2 或4 倍連續稀釋?zhuān)尤朊笜税?/span>
試驗材料：
（1）抗原：陽(yáng)性抗原：采用C6/36 細胞感染登革病毒培養物為陽(yáng)性抗原。
陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36 細胞為陰性抗原對照。
（2）抗人IgM（μ 鏈）單克隆抗體或多克隆抗體；
（3）登革病毒IgM 陽(yáng)性、陰性對照血清；
（4）辣根過(guò)氧化物酶標記登革病毒單克隆抗體；
（5）緩沖液：
洗滌液：pH7.4 PBS－T（0.05％吐溫－20）；
稀釋液：pH7.4 PBS（5％牛血清）；
封閉液：pH9.6 碳酸緩沖液（1％牛血清白蛋白）；
（6）顯色液：A/B 液
（7）終止液：4N H2SO4
（8）酶標板、酶標儀。
檢測步驟：
（1）用稀釋液按效價(jià)稀釋抗人μ 鏈單克隆抗體，100μl/孔，加蓋，4℃過(guò)
夜；
（2）棄去抗人μ 鏈，用洗滌液重復洗3 次，甩干，加封閉液，100μl/孔，
置37℃水浴孵育2 小時(shí)；
（3）棄封閉液，用洗滌液重復洗3 次，甩干。
（4）將待檢血清用稀釋液從1：10 開(kāi)始作2 或4 倍連續稀釋?zhuān)尤朊笜税?/span>
孔中，100μl/孔，同時(shí)加入已1：10 稀釋的陽(yáng)性血清、陰性血清對照各4 孔,
100μl/孔，置37℃水浴孵育2 小時(shí)；
（5）棄去血清，用洗滌液重復洗3 次，甩干，分別加4 個(gè)型DV 抗原及陰性
抗原對照，100μl/孔，4℃過(guò)夜；
（6）棄抗原，用洗滌液重復洗3 次，甩干，加用稀釋液稀釋至工作濃度的
相應的登革熱酶標單克隆抗體，正?？乖? 個(gè)型混合的酶標單克隆抗體，
100μl/孔，37℃水浴2 小時(shí)；
（7）棄去標記物，用洗滌液重復洗3 次，甩干，于各反應孔內加A/B 液各一滴，37℃，避光3～5 分鐘；
（8）加終止液于每反應孔，一滴/孔。
結果判斷：
（1）目測方法：
陽(yáng)性對照孔呈明顯藍色，陰性對照孔呈無(wú)色，對照成立；若待檢血清孔呈明
顯淡藍色或深藍色（TMB），則標本為登革熱IgM 抗體陽(yáng)性，反之陰性。
（2）酶聯(lián)免疫檢測儀檢測：
于450nm（TMB）陽(yáng)性對照孔OD 值/陰性對照孔OD 值，即P/N≥2.1，對照成
立；若待檢血清孔OD 值與陰性對照孔OD 比值≥2.1，則標本為登革熱IgM 抗體
陽(yáng)性，反之陰性。（陰性對照孔OD 值小于0.05 按0.05 記，若大于0.05 按實(shí)際
數值計算）
意義：
陽(yáng)性結果，表明患者新近DV 感染，用于登革熱早期診斷。
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