1. 傳統分離培養檢測及鑒定方法
食品中單增李斯特菌的傳統檢驗方法是將分離培養后的可疑菌落做生化反應實(shí)驗、溶血實(shí)驗、協(xié)同溶血實(shí)驗(CAMP)、動(dòng)物實(shí)驗及典型運動(dòng)等鑒定,被確定為李斯特菌后進(jìn)一步進(jìn)行血清分型; 增菌和選擇性增菌是不可缺少的步驟,而增菌主要包括兩種:冷增菌和快速增菌。前者是將樣品置于胰蛋白胨水中4℃～5℃增菌1個(gè)月,再劃線(xiàn)分離;由于冷增菌時(shí)間長(cháng)(4℃, 30 d甚至1年),已被快速增菌法取代。國際常用的增菌法主要有國際乳業(yè)聯(lián)盟(IDF)、美國食品藥品管理局(FDA)及美國農業(yè)部(USDA)的增菌法。IDF法是將待檢樣品接IDF法是將待檢樣品接種于EB培養基,經(jīng)30℃, 48h培養后,于OXFORD平板劃線(xiàn)分離,選擇培養,然后用斜光法觀(guān)察菌落, CAMP檢驗,最后鑒定分型。 FDA為美國官方負責食品衛生監督的機構,其所制定的方法為國際上公認的權威方法之一,因此許多檢測方法都以FDA法作為對比參照。其主要步驟是將樣品接種在含放線(xiàn)菌酮的LEB肉湯中培養,分別在第1天和第7天轉接在MMLA平板上分離。USDA法是將樣品接種在UVM-LEB(university of Vermont modified Lisiteria enrichment broth)肉湯中,再轉到FB(Fraser broth)培養基中,分別在30℃和35℃兩次增菌,于MMLA或MOX平板上劃線(xiàn)分離。

除上述3種方法外,國際標準化組織(ISO)在ISO11290-1中采用增菌液為DFB(demi-fraser broth)和FB的兩級增菌法。另外還有一種RSK法,也是采用兩次增菌, 20h可使單增李斯特菌達到107個(gè)/ml。我國使用的檢測單增李斯特菌方法主要有國標法(GB 4789.30-1994)和SN法(SN0 184-1993)。

國標法在LEB中前增菌后,劃線(xiàn)于選擇性培養基MMA,再分別于SIM和TSI上分離培養,其后于TSA-YE培養基上純化菌落,進(jìn)一步做生化鑒定,報告結果。SN法一般將樣品置于MBP中前增菌,然后在EB中增菌,分別劃MMA和OXA平板,于TSA-YE平板上純化菌落,純化的菌落接種于TSB-YE中培養過(guò)夜進(jìn)行生化實(shí)驗,報告結果。

2. 顯色培養基快速鑒定技術(shù)
基本原理：針對單增李斯特菌的β-D-葡萄糖苷酶和毒力因子PI-PLC酶,設計相應的底物,加入到常規選擇性培養基中,利用酶對底物的分解,產(chǎn)生熒光物質(zhì)或顯色物質(zhì),使其菌落形態(tài)或顏色不同于其他李斯特菌和非李斯特菌,從而實(shí)現對單增李斯特菌快速定性鑒定和菌落數目的快速定量。Notermans等1991年首次用plcA基因產(chǎn)物磷脂酰肌醇(PI)特異性的磷脂酶C(PI-PLC)來(lái)檢測單增李斯特菌,通過(guò)與L-α-磷脂酰肌醇顯色底物進(jìn)行特異性生化反應,在菌落周?chē)a(chǎn)生不溶于水的脂肪酸,形成明顯的沉淀環(huán),實(shí)現對單增李斯特菌的一步鑒定。另一種PI-PLC的底物是5-溴-4-氯-3-吲哚-肌醇-1-磷酸鹽,致病性的單增李斯特菌在以該底物設計的顯色培養基上呈現出綠色的菌落,無(wú)致病性李斯特菌為白色菌落。Facon和Simon于1998年利用該物質(zhì)作底物開(kāi)發(fā)成功顯色培養基并申請了專(zhuān)利。在同一年, Schabert和Restaino利用4-甲基傘形酮-肌醇-1-磷酸鹽作為PI-PLC酶的底物,開(kāi)發(fā)出熒光顯色培養基,也申請了專(zhuān)利。 

3. 數值分類(lèi)鑒定和新型計數技術(shù)
對傳統的生化反應進(jìn)行統計分析,找出代表李斯特菌的特征性生化反應,利用數值分類(lèi)技術(shù),編出相應的代碼表,簡(jiǎn)化傳統的生化鑒定步驟,達到快速鑒定。最有代表性的就是現在商業(yè)化的微量生化鑒定管,其中最常用且普遍被認可的是TheAPI-Listeria test。它共包括10個(gè)生化反應,通過(guò)查詢(xún)代碼表可以對單增李斯特菌和李斯特屬內的菌種快速鑒定。傳統的計數以平板計數和MPN兩種方法為主。傳統的計數以平板計數和MPN兩種方法為主。目前有多種技術(shù)將常規培養方法進(jìn)行了改進(jìn)或替代,主要體現在勿需瓊脂平板或簡(jiǎn)化瓊脂傾注平板。其中的疏水網(wǎng)膜(HGMF)技術(shù)適用于好氧菌計數,它采用的ISO-GRIO系統,具有1600個(gè)小方格的網(wǎng)膜,能濃縮樣品細菌,除去抑制物,同時(shí)利于細菌在培養基間轉移時(shí)活力的恢復。 

4. 免疫檢測技術(shù)
Farber等首先于1987年報道了針對單增李斯特菌鞭毛抗原的單克隆抗體ELISA檢驗程序。首先用硝酸纖維素膜過(guò)濾污染樣品,然后將濾膜置于改良的McBride李斯特菌分離培養基上,在30℃下培養48 h后移去膜,用對單增李斯特菌特異的單抗酶免疫法檢驗,該法可在2～3 d內從自然污染樣品中檢出單增李斯特菌。1992年,Bessesen等利用淋巴細胞雜交瘤技術(shù),首次制備一株能穩定分泌抗單核增生李斯特菌特異性克隆抗體的細胞株em-7g1,所針對的蛋白質(zhì)分子量為60kd。以此特異的單克隆抗 體建立的夾心ELISA方法能于20～24 h內檢測出8～10 cfu/g(ml),這在病原性李斯特菌的檢測方面實(shí)現了一次重大突破,第一次利用免疫學(xué)方法把單增李斯特菌與非病原性李斯特菌分開(kāi)。以抗原抗體免疫為基礎, Tao Geng等(2004)研制的生物傳感器可在24h內檢測出熱狗和香腸中污染的單增李斯特菌,增菌后可檢測10～100 cfu/g樣品。

5. 分子檢測技術(shù)
5.1　探針檢測技術(shù)　
Data等1988年克隆出單增李斯特菌β溶血素基因的一個(gè)500bp DNA片斷并測序,以此序列合成4種寡核苷酸探針,以32P標記該探針經(jīng)斑點(diǎn)雜交試驗證實(shí),該探針只與單增李斯特菌反應,與其他種的李斯特和屬外的細菌均呈陰性,表現出很好的特異性。Notermans S.等1989年克隆出編碼單增李斯特菌和英諾克李斯特菌的引起遲發(fā)性變態(tài)反應的基因(DTH-18)。該基因經(jīng)32P標記制備成基因探針,通過(guò)斑點(diǎn)雜交能檢出絕大多數血清型的單增李斯特菌和英諾克李斯特菌。除了DNA分子可作為很好的靶序列外, RNA也是個(gè)很好的選擇,VITR Listeriakit就是針對RNA開(kāi)發(fā)的探針試劑盒。Roger Stephan等(2003)報告3h內可得到結果,效果非常好。

5.2　PCR檢測技術(shù)　
用于PCR檢測的特異引物,一種是依據單增李斯特菌的特異毒力基因序列設計,常以hlyA、iap、inl、Dth-18作為靶序列。Xiaohui Zhou等2003年以actA作為靶序列,設計引物,擴增產(chǎn)物827bp,對單增李斯特菌有很高特異性,經(jīng)過(guò)在LEB中30℃16h增菌后,可達到在25g牛肉、25ml水或牛奶中檢出10cfu的水平。另一種是以單增李斯特菌的16S序列或16S/23S中間保守區域為靶序列設計引物,用PCR技術(shù)對單核增生李斯特菌的特異性進(jìn)行研究。 定量PCR技術(shù)的發(fā)展,科研人員開(kāi)始嘗試以分子手段對單增李斯特菌快速計數。Nogva et al運用5′-核酸酶PCR對單增李斯特菌定量,Weon Sang Choi等運用cPCR對單增李斯特菌進(jìn)行定量。近年來(lái)采用PCR技術(shù)對單增李斯特菌檢測,研究重點(diǎn)放在了樣品前處理方面。 G.Amagliania等利用順磁納米顆粒和傳統的苯酚、氯仿對樣品中DNA進(jìn)行更有效提取,以去除對PCR擴增的抑制因素,盡量避免培養增菌過(guò)程,從而大大提高特異性和減少檢測時(shí)間?，F在已經(jīng)有很多基于PCR技術(shù)開(kāi)發(fā)的商業(yè)化試劑盒,其BAX_system已在2002年被英國農業(yè)食品安全和監測局(FSIS)采納用來(lái)檢測鮭魚(yú)中的單增李斯特菌。B.Becker等報告BAX系統檢測27個(gè)樣品,其中26個(gè)與標準方法DIN11290-1和DIN 11290-2一致,只有一例假陽(yáng)性。在自然污染的樣品檢測中,培養24～48h后即得到較好的結果。

5.4　免疫-PCR檢測技術(shù)　
Fluit等將免疫技術(shù)和PCR技術(shù)相結合,建立了新的檢測系統磁免疫PCR。它以單增李斯特菌單抗MAb55和MAbA包被磁珠,對樣品進(jìn)行前處理,將菌富集裂解,再以DTH基因設計引物進(jìn)行PCR,并以hlyA基因設計引物做進(jìn)一步驗證,顯示單抗MAb55效果較好,可檢測出每g樣品一個(gè)細菌,十分靈敏。

廣州健侖生物科技有限公司 

徐進(jìn) 

2010/12/09