沙門(mén)氏菌屬診斷血清學(xué)試驗操作程序
1. 目的
制定沙門(mén)氏菌屬診斷血清使用程序，指導對沙門(mén)氏菌屬進(jìn)行血清學(xué)分型。
2. 原理
用沙門(mén)氏菌屬的代表菌株制成滅活菌抗原分別或混合免疫家兔所得的血清，經(jīng)吸收出去非特異性凝集素后制成，通過(guò)凝集試驗原理供沙門(mén)氏菌屬常見(jiàn)菌型定型。
3. 試劑及實(shí)驗設備
3.1 沙門(mén)氏菌屬診斷血清
3.2 試劑保存：2~8°C避光保存，防止凍結，在有效期內使用。
3.3 實(shí)驗設備：玻片、吸樣槍、接種環(huán)、水浴箱、玻璃管、血平板、營(yíng)養瓊脂、電熱高溫接種滅菌器。
4. 程序步驟
4.1 將診斷血清于冰箱取出后平衡至室溫。
4.2 選擇經(jīng)初步生化檢測符合沙門(mén)菌生物特性的疑似菌落。
4.3 菌群分析
將經(jīng)18~24h血平板上純培養的待檢菌，先用O多價(jià)A~F群血清進(jìn)行凝集試驗，如陽(yáng)性，提示待檢菌可能屬于A(yíng)~F群范圍內，因97%以上的沙門(mén)菌都包括在A(yíng)~F6個(gè)O群之內，如果不凝再使用其他O抗血清進(jìn)行凝集試驗，如與其中一種抗血清凝集，待檢菌即屬于相應的菌群。若與多價(jià)O抗血清不凝集，有如下3種可能：①含有Vi抗原；②A(yíng)~FO群之外的沙門(mén)菌；③沙門(mén)氏菌屬以外的細菌?？砂聪率龇椒ㄟM(jìn)一步檢測，將純菌落用無(wú)菌生理鹽水洗下，制成濃菌液，再分成2份。1份不經(jīng)處理，為活菌液，另1份放100°C水浴中30min，為加熱菌液。取活菌與Vi抗血清，取加熱菌與Vi抗血清凝集，加熱菌與Vi抗血清、A~F多價(jià)O抗血清分別進(jìn)行玻片凝集試驗。根據結果作如下分析：①活菌與Vi抗血清凝集，加熱菌與Vi抗血清凝集者，可能屬于C群或D群菌，用O7和O9抗血清定群；②活菌與Vi抗血清不凝，可能屬于A(yíng)~FO群之外的沙門(mén)菌或其他菌屬細菌，需進(jìn)行生化試驗定屬，若符合沙門(mén)氏菌屬細菌特征，可送CDC鑒定；③加熱菌與Vi抗血清凝集，而與A~F多價(jià)O抗血清不凝集者，可報告為陰性。
4.4 血清型分析
菌群確定后，分析被檢菌的鞭毛抗原成分。先分析第1相鞭毛抗原，再分析第2相鞭毛抗原。第1相鞭毛抗原分析：根據菌群分析結果，分別選用第1相鞭毛因子血清進(jìn)行玻片凝集試驗。第2相鞭毛抗原分析：所用抗血清，通常是復合因子（1、2、3、5、6、e、n、I、w）血清。單相菌，如第1相已確定，可結合菌群分析及生化反應結果判斷血清型。如為雙相菌，只分析出第1相鞭毛抗原，大多數也可結合菌群分析和生化結果判斷血清型，必要時(shí)進(jìn)一步探索第2相鞭毛抗原。若只分析出第2相鞭毛抗原，須進(jìn)一步探索分析第1相抗原。探索另1相抗原可按下述方法和步驟進(jìn)行。如“小內管”法，一支已融化半固體瓊脂，插入一支無(wú)菌兩端相通小玻璃管于培養基當中，長(cháng)度稍高出半固體液面。待瓊脂泠卻凝固，用接種環(huán)取1~2環(huán)待抑制相H抗血清，放入小內管的瓊脂表面，然后接種被誘導菌株于小內管含抗血清瓊脂層面，35°C孵育4~6h或過(guò)夜，取小內管外半固體瓊脂層生長(cháng)培養物，接種于平板或直接做凝集反應，可獲得待誘導相的菌株。有些種的確定是靠鞭毛抗原中的微小差異來(lái)分析的，因而獲得豐富鞭毛抗原的培養物十分重要。
4.5 將經(jīng)18~24h血平板上純培養的待檢菌，用生理鹽水制備2麥氏單位的菌懸液，取診斷血清20μL于潔凈玻片上，然后取20μL待檢菌懸液與血清混勻，輕輕搖動(dòng)玻片，1min內呈現明顯凝集者為陽(yáng)性，呈均勻渾濁者為陰性，每次凝集試驗均應以生理鹽水作為陰性對照試驗。
4.6 根據其生化反應和與O抗血清、Vi抗血清、H抗血清的凝集結果對照沙門(mén)氏菌屬?lài)鴥瘸Ｒ?jiàn)菌型診斷抗原表，確定沙門(mén)菌的菌型。
4.7 沙門(mén)氏菌屬?lài)鴥瘸Ｒ?jiàn)菌型診斷抗原，見(jiàn)附表
5. 質(zhì)量控制
O多價(jià)A~F群血清選擇傷寒沙門(mén)菌ATCC14028為陽(yáng)性對照；大腸埃希菌ATCC25922為陰性對照
6. 質(zhì)量記錄
7. 參考文獻
[1] 盧錦漢主編.醫學(xué)生物制品學(xué).北京.人民衛生出版社.1995
[2] 中國生物制品規程（2000年版）.北京.化學(xué)工業(yè)出版社.2000
附表：沙門(mén)氏菌屬?lài)鴥瘸Ｒ?jiàn)菌型診斷抗原表
|
O 群 |
血清型 |
抗原式 |
|
O:2（A） |
甲型副傷寒（Paratyphi-A） |
1,2,12:a:- |
|
O:4（B） |
德比（Derby） 阿哥納（Agona） 鼠傷寒（Typhimurium） 乙型副傷寒（Paratyphi-B） 斯坦利（Stanley） 圣保羅（Saintpaul） |
1,4,12:f,g:- 1,4,12:f,g,s:- 1,4,5,12:i:l,2 1,4,5,12:b:l,2 1,4,5,12:d:l,2 1,4,5,12:e,h:l,2 |
|
O:7（C1） |
湯卜遜（Thompson） 波茨坦（Potsdam） 豬霍亂或丙型副傷寒（Choleraesuis or Paratyphi-C） 嬰兒（Infantis） |
6,7:k:l,5 6,7:l,v:e,n,z15 67,(Vi):c:l,5
6,7:r:l,5 |
|
O:8（C2） |
紐波特（Newport） 曼哈頓（Manhattan） 病牛（Bovismorbificans） 科特布斯（Kottbus） |
6,8:e,h:l,2 6,8:d:l,5 6,8:r:l,5 6,8:e,h:l,5 |
|
O:9（D1） |
傷寒（Typhi） 爪哇那（Javiana） 雞（Gallinarum） |
9,12,(Vi):d:- 1,9,12:l,z28:1,6 1,9,12:-:- |
|
O:3,10（E1-E2） |
鴨（Anatum） 火雞（Meleagridis） 倫敦（London） 紐蘭（Newlands） |
3,10(15):e,h:l,6 3,10(15)e,h:l,w 3,10:l,v:1,6 3,10:e,h:e,n,x |
|
O:1,3,19（E4） |
山夫登堡（Senftenberg） 塔克松尼（Taksony） |
1,3,19:g,s,t:- 1,3,19:i:z6 |
|
O:11（F） |
阿伯?。?/span>Aberdeen） |
11:i:1,2 |
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