呼吸道合胞病IgM檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

1、實(shí)驗原理

此酶免試劑盒可用于人血清中抗RSV（呼吸道合胞病毒）IgM抗體的體外定性和定量檢測。

2、前言說(shuō)明

在患有細支氣管炎或肺炎的六個(gè)月大的嬰兒中，可發(fā)現呼吸道RSV感染和特定的臨床癥狀之間有明顯的聯(lián)系。在年齡稍大 的嬰兒和小兒中，感染癥狀會(huì )溫和一些。 25%以上的RSV呼吸道感染都是可被察覺(jué)的。由于RSV再次感染的可能性，人們認為這些再次感染的抗體與成年人中這些疾病的緩慢發(fā)展過(guò)程（類(lèi)似于感冒） 有關(guān)。然而，特別是早年，血清抗體并不能成為抗呼吸道感染的有效保護。因此，這種病原體可能會(huì )引起細支氣管炎或引起四歲大的嬰兒患肺炎?；诤粑篮习? 毒抗原的關(guān)系，我們可以將呼吸道合胞病毒分為兩大類(lèi)（A和B）。病毒的表面糖蛋白（G糖蛋白和融合糖蛋白）可產(chǎn)生病毒抑制抗體。RSV的A和B類(lèi)病毒的G 糖蛋白與F糖蛋白相比明顯不同。用于RSV血清學(xué)診斷的補體結合實(shí)驗，其結果不是很理想。用于RSV感染的血清學(xué)診斷的酶免檢測具有很高的診斷價(jià)值，因為 酶免檢測靈敏度很高，并且可區分不同抗原的免疫球蛋白。在RSV感染中，IgM抗體反應可能不會(huì )出現或很弱，以至于不能獲得可靠的實(shí)驗結果。在一急性感染 中，因為IgA抗體可能會(huì )持續幾個(gè)月或幾年，所以單一樣品中的IgG抗體檢測并不明顯。被推薦為急性RSV感染血清學(xué)檢測方法是檢測血清中的IgG抗體 （雙份，要求其濃度明顯提高了）。

3、實(shí)驗原理

此固相ELISA試劑盒利用的夾心法原理。包被板上包被了抗原。用對人IgM具有特異性的酶標二抗來(lái)檢測結合到包被抗原的樣品特異性抗體。底物反應后，所顯示的顏色強度與檢測到的IgM特異性抗體的量成正比。樣品的結果可直接使用標準曲線(xiàn)得。

4、試劑盒組成：

4×2ml	標準品A-D	1；10；50；150U/mL，待用 標準品A=陰性質(zhì)控           標準品B=臨界質(zhì)控 標準品C=弱陽(yáng)性質(zhì)控         標準品D=陽(yáng)性質(zhì)控 內含抗RSV的IgM抗體，PBS（磷酸緩沖液），穩定劑。
1×14ml	酶標IgM	紅色，待用。內含過(guò)氧酶標記的抗人IgM，蛋白緩沖液，穩定劑。
1×12×8	包被板	可拆，包被有特異性抗原。
1×14ml	TMB底物液	含TMB
1×14ml	TMB終止液	0.5M的H2SO4
1×60ml	稀釋液	含PBS緩沖液，＜0.1%NaN3
1×60ml	濃縮洗滌液	濃縮型（10×），含PBS緩沖液，吐溫20
2×	粘性金屬板	用于在溫育時(shí)遮蓋包被板
1×	塑料袋	用于儲存不用的板條

5、實(shí)驗所需材料但試劑盒不提供

1)        RF吸附劑

2)        移液器，體積：5；50；100；500 μL

3)        校準儀

4)        樣品稀釋用試管（1ml）

5)        帶試劑儲器8道移液器

6)        洗滌瓶，自動(dòng)或半自動(dòng)洗板機

7)        能在450nm處讀數的酶標儀

8)        雙蒸水或去離子水

9)        吸水紙，取樣吸頭和計時(shí)器

6、實(shí)驗前的準備說(shuō)明

6.1成分準備

稀釋/溶解	成分		稀釋液	比例	備注	貯存	穩定性
60ml	洗滌液	加600ml	雙蒸水	1：10	加熱至37°C以溶解 結晶，充分混合	2-8°C	8周

6.2樣品稀釋

樣品	稀釋	稀釋液	比例	備注
血清/血漿	全部稀釋	稀釋緩沖液	1：101	例：5μL+500μL

樣品中IgM濃度高于最高標準品的應當進(jìn)一步稀釋。

6.3用RF吸附劑處理：

注意	為了避免特異性IgG和類(lèi)風(fēng)濕因子的干擾，病人的血清應當用RF吸附劑處理(RE59059)。 標準品和質(zhì)控品千萬(wàn)不要用RF吸附劑處理。
1.	在400μL按1：101的比例稀釋的樣品中加入20μL RF吸附劑。充分混合。
2.	室溫（18-25℃）下溫育≥1min（﹤15min）

為了避免吸附特異性抗體，應當避免溫育時(shí)間﹥15min。

預處理的樣品可能會(huì )是渾濁的。

7、實(shí)驗步驟：

1)        加100μL標準品和已稀釋樣本于相應反應孔中，在定性檢測中只使用標準品B。

2)        封板后室溫（18℃-25℃）溫育60分鐘。

3)        移去粘性金屬板，棄去孔中液體。用300μL洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干。

4)        在每一微孔中加入100μL酶聯(lián)物。

5)        封板后室溫（18℃-25℃）溫育30分鐘。

6)        移去粘性金屬板，棄去孔中液體。用300μL洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干。加底物液和終止液時(shí)，如果有條件的話(huà)，可使用8孔微量移液器。確保底物液和終止液都是相同的時(shí)間間隔加入。使用確切容積并避免氣泡產(chǎn)生。

7)        每孔加TMB底物液100μL。

8)        室溫（18℃-25℃）避光溫育20分鐘。

9)        在每一微孔中加入100μLTMB終止液以終止底物反應。輕輕搖動(dòng)包被板以使試劑混合均勻。此時(shí)，顏色藍色變成黃色。

10)     加終止液后60分鐘內在450nm處測OD值。

8、結果計算

在半對數坐標紙上或用自動(dòng)生成的方法，以標準品的OD值為Y軸，濃度為X軸，繪制一標準曲線(xiàn)圖。用立體圖、4參數對 數圖或對數-對數圖都可獲得良好的實(shí)驗結果。對于標準曲線(xiàn)圖，用標準品的每一單值進(jìn)行計算（樣品結果明顯異常的值必須刪除掉，應使用更加合理的單值）。樣 品的濃度可直接從標準曲線(xiàn)上獲得。一旦樣品稀釋了，就應當乘以相應的稀釋因子。如果樣品所測得的濃度高于最高標準，則應根據實(shí)驗前的準備說(shuō)明所述對樣品進(jìn) 行稀釋?zhuān)⒅匦聶z測。

9、結果判定： ＞12 U/ml  為陽(yáng)性,8 - 12 U/ml  為可疑,＜ 8 U/ml  為陰性

此檢測結果并不是任何治療結果判定的唯一因素，它應當結合臨床觀(guān)察和診斷結果加以判斷。

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