人胎球蛋白A檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）

預期用途
此試劑盒可用于血清，血漿，細胞上清，組織提取物和尿液中人胎球蛋白A也稱(chēng)之為α-2-HS糖蛋白的定量的檢測；血清或血漿中胎球蛋白A的檢測可作為某些癌癥及基因遺傳缺陷的血清蛋白診斷的輔助工具；此試劑盒僅供實(shí)驗室專(zhuān)業(yè)人士使用
簡(jiǎn)介
胎球蛋白A也稱(chēng)之為α-2-HS糖蛋白，是由兩個(gè)氨基末端抑制域和一個(gè)較小的羧基末端域組成的59 kDa 分子量的糖蛋白；由肝臟合成，分泌至血流，成年哺乳動(dòng)物體內的濃度范圍在0.5-1.0g/L；嬰兒期的血清胎球蛋白A含量高，參與蛋白酶抑制活性，與鈣代謝和骨生成調節相關(guān)；累積于骨和牙齒內，作為生物學(xué)上非膠原骨蛋白的主要部分，研究表明，胎球蛋白A是循環(huán)中主要的鈣化抑制劑；干涉鈣鹽沉淀；近期研究顯示低水平胎球蛋白A的慢性腎臟衰竭患者與心血管病的高死亡率顯著(zhù)相關(guān)；另一方面，糖尿病老年人血清胎球蛋白A含量比正常人高，這是獨立于胰島素抑制劑的其他標記物；另外，高胎球蛋白A水平還可作為心血管疾病的的危險標記物 
實(shí)驗原理
此試劑盒可用于血清樣本中人胎球蛋白A的定量檢測；采用雙位點(diǎn)夾心法，羊抗人胎球蛋白A多抗結合人胎球蛋白A的不同位點(diǎn)
將含人胎球蛋白A的試驗標準品，質(zhì)控品和預稀釋樣本加至包被了高度親和羊抗人胎球蛋白A多抗的微孔內，第一次孵育，包被抗體捕獲樣本中的人胎球蛋白A，未結合的蛋白洗板除去，然后加入HRP標記的抗人胎球蛋白A酶聯(lián)物加入至每孔，“夾心-人胎球蛋白A-HRP-標記的酶聯(lián)物”形成夾心，未結合的示蹤抗體通過(guò)洗板除去，結合于包被板上的HRP酶免物與底物液定時(shí)反應，然后在酶標儀上檢測；結合于包被胎球蛋白A上示蹤抗體酶活性與樣本中胎球蛋白A的含量直接相關(guān)，在點(diǎn)對點(diǎn)或三次回歸模式下以標準品的濃度比上OD值繪制標準曲線(xiàn)，樣本中的胎球蛋白A可直接從標準曲線(xiàn)上得到
試劑：準備與貯存
此試劑盒收到后立即貯存于2-8℃下，效期見(jiàn)試劑盒標簽；所有成分在2-8℃下可保存至有效期
使用前，所有試劑平衡至室溫，不同批次的試劑不能交換使用

包被板，96孔，包被了抗人胎球蛋白A抗體；微孔板固定于板架上，密封于含有干燥劑的鋁箔密封袋內；貯存于2-8℃至有效期

胎球蛋白A示蹤抗體，1瓶，0.6 ml，濃縮，HRP標記的抗人胎球蛋白A示蹤抗體溶于穩定的蛋白基質(zhì)中；此試劑使用前需用示蹤劑抗體稀釋液進(jìn)行稀釋?zhuān)毁A存于2-8℃至有效期

示蹤抗體稀釋液，1瓶，11ml，即用，Trizma鹽酸溶于緩沖液；根據實(shí)驗步驟用于示蹤抗體稀釋?zhuān)毁A存于2-8℃至有效期

試驗緩沖液，濃縮，1瓶，11ml，含牛血清白蛋白的磷酸緩沖鹽；建議使用前以1:10比例用雙蒸水稀釋?zhuān)ㄈ?/span>11 ml濃縮+99 ml的雙蒸水）；貯存于2-8℃至有效期

洗滌液，濃縮，1瓶，20ml，30倍濃縮；試驗前需用580ml的雙蒸水稀釋?zhuān)靹?；一旦稀釋?zhuān)缓B氮化物防腐劑的磷酸緩沖鹽洗滌液會(huì )含表面活性劑；稀釋的洗滌液在室溫下可保存至效期

HRP底物液；1瓶，12ml，含過(guò)氧化氫的TMB底物液；貯存于2-8℃至有效期

終止液，1瓶，12ml，0.5M硫酸，貯存于2-8℃至有效期

胎球蛋白A標準品，5瓶，含胎球蛋白A，不含疊氮化物防腐劑的液態(tài)牛血清基質(zhì)；各標準品濃度見(jiàn)瓶子標簽；3次凍存周期使用后，所有標準品保存至-20℃或更低

胎球蛋白A質(zhì)控，2瓶，含人胎球蛋白A，不含疊氮化物防腐劑的液態(tài)牛血清基質(zhì)，各質(zhì)控的精確濃度范圍見(jiàn)瓶子標簽，3次凍存周期使用后質(zhì)控保存至-20℃或更低

安全注意事項

此試劑用于臨床參考實(shí)驗室，僅供醫生或實(shí)驗室專(zhuān)業(yè)人士體外診斷用

若試劑是有潛在感染風(fēng)險的，試驗操作和處理時(shí)應戴手套

避免接觸含TMB，過(guò)氧化氫，硫酸的試劑，TM,B會(huì )刺激皮膚和粘膜，導致皮膚過(guò)敏反應；TMB還可能是致癌物質(zhì)；皮膚接觸到硫酸會(huì )導致嚴重灼傷，不要接觸到眼睛，皮膚，衣服，不要吸入煙霧，一旦接觸，應立即用大量水沖洗至少15min

良好實(shí)驗室操作規范

實(shí)驗所需材料但試劑盒未提供

精確的單通道移液器，10-25-100-1000ul

適于100 ul的可重復用分液器

適于所有體積的一次性槍頭

一次性玻璃管或塑料管12x75mm或13x100mm

帶蓋的一次性塑料瓶；100-1000ml

鋁箔紙

雙蒸水或去離子水

塑料蓋板或聚乙烯薄膜

多通道洗滌瓶或全自動(dòng)（半自動(dòng)）洗板系統

酶標儀，450nm

樣本采集
人胎球蛋白A的檢測所需血清或血漿樣本量?jì)H10 ul
個(gè)人在采樣前無(wú)需特殊準備，全血采集，室溫下立即凝集30min，然后離心分離出血清（850-1500 xg 10min）。全血采集3小時(shí)內需將血清從凝集中分離出來(lái)，轉移至另一干凈試管；血清樣本可保存在-20℃或更低，避免超過(guò)三次的凍融
建議采用24小時(shí)尿液來(lái)檢測尿液中的胎球蛋白A；采集第二天早晨的尿液，排除采樣前剛進(jìn)行劇烈運動(dòng)的，因腎功能不全導致多尿的；由利尿藥引起的人體內尿蛋白含量波動(dòng)降低，可能與尿肌酸酐濃度相關(guān)；
細胞上清，組織提取物則需進(jìn)行試驗樣本的倍比稀釋?zhuān)欢鄠€(gè)平行樣檢測得到更精確的試驗結果
 
實(shí)驗步驟
患者樣本的準備
患者血清或血漿樣本在檢測前需用試驗緩沖液進(jìn)行1:10000 的稀釋

以1A和1B 標記兩個(gè)試管（12x75 mm）

加1ml的試驗緩沖液至各試管（1A和1B）

加10 ul的患者血清至1A試管，混合（1:100）

從1A管內吸取10ul已稀釋的樣本至1B試管，混合（1:10000）

注意：建議采用精確/經(jīng)校準的移液器，稀釋過(guò)程小心操作，得到更精確的結果；建議采用多通道（Combitip）12.5ml的Eppendorf可重復移液器加1ml的試驗緩沖液，而不用50ml的槍頭

患者尿液樣本的實(shí)驗前用試驗緩沖液1:100的稀釋

以1標記一試管（12x75 mm）

各管加1ml試驗緩沖液

加10ul患者尿液樣本至1管，混合（1:100）

注意：若所得結果中樣本濃度高于5個(gè)標準品中的最高標準品濃度，則尿液樣本需進(jìn)一步稀釋?zhuān)ㄈ?/span>1:500），然后重新檢測

試劑準備

試驗前將所有試劑平衡至室溫，不同批次的試劑不能混合使用

使用前，試驗緩沖液（濃縮）及洗滌液（濃縮）需進(jìn)行稀釋?zhuān)渲瞥晒ぷ饕?；詳情請?jiàn)“試劑”部分

試驗操作

將實(shí)驗所需板條固定于板架上，標準品，質(zhì)控品及未知樣本做雙孔檢測

試驗布局

ROW	STRIP 1	STRIP 2	STRIP 3
A	STD 1	STD 5	SAMPLE 2
B	STD 1	STD 5	SAMPLE 2
C	STD 2	C 1	SAMPLE 3
D	STD 2	C 1	SAMPLE 3
E	STD 3	C 2
F	STD 3	C 2
G	STD 4	SAMPLE 1
H	STD 4	SAMPLE 1

加25 ul的標準品，質(zhì)控品及預稀釋的1:10000樣本至相應孔內；注意：尿液樣本是1:100的稀釋

每孔加100 ul的試驗緩沖液

混勻，蓋板，避免暴露于陽(yáng)光下

室溫下孵育2小時(shí)

示蹤抗體工作液的準備，示蹤抗體1:21的用示蹤抗體稀釋液稀釋?zhuān)幻織l板需1ml的示蹤抗體稀釋液+50 ul的胎球蛋白A示蹤抗體

移去蓋板，棄去孔內反應液，每孔加350ul的洗滌工作液洗板5次，然后徹底吸出孔內液體，或可采用全自動(dòng)洗板機

以上稀釋的示蹤抗體工作液加100 ul至各孔

蓋板，避免暴露于陽(yáng)光下

室溫下孵育30min

移去蓋板，棄去孔內反應液，每孔加350ul的洗滌工作液洗板5次，然后徹底吸出孔內液體，或可采用全自動(dòng)洗板機

每孔加100 ul的ELISA HRP 底物液

蓋板，避免暴露于陽(yáng)光下

室溫下孵育20min

移去蓋板，每孔加100 ul的終止液，混勻

10min 內在450nm酶標儀上檢測吸收值

注意：為降低背景色，可以雙波長(cháng)檢測，設置參考波長(cháng)：595nm 或620 nm 或630nm
操作注意事項

建議所有標準品，質(zhì)控品和未知樣本做雙孔檢測；各雙孔檢測的吸收均值用于數據處理，結果計算

將光敏試劑保持裝于原琥珀色瓶?jì)?/span>

將剩余的包被板條放存在含干燥劑的密封袋內，避免受潮

操作嚴格，移液器經(jīng)校準可確保試驗的可重復性

孵育時(shí)間或溫度也可能會(huì )影響試驗結果

避免微孔內產(chǎn)生氣泡，可能會(huì )導致結合率低，雙孔讀數變異系數高

使用前所有試劑都應徹底混勻，避免產(chǎn)生氣泡
結果說(shuō)明

計算各雙孔吸收值均值

所有的吸收均值都減去標準品1（即0ng/ml）的吸收均值

在點(diǎn)對點(diǎn)或對數-對數坐標紙上以標準品的濃度為X軸，吸收均值為Y軸繪制標準曲線(xiàn)；或是采用數據處理軟件進(jìn)行結果計算

質(zhì)控品和樣本濃度（1:10000）可直接從標準曲線(xiàn)上讀取，若采用的是對數-對數或數據處理軟件計算則需用到對數轉換；樣本校正吸收值在濃度1ng/ml 和下一個(gè)最高標準品間的需通過(guò)公式計算：

未知樣本濃度=	未知樣本吸收值	x   2nd 標準品濃度值
	2nd 標準品吸光值

典型標準曲線(xiàn)
以下為典型示例的吸收值及標準曲線(xiàn)；此標準曲線(xiàn)不能用于其他實(shí)驗的計算

人胎球蛋白A分析靈敏度，零標準品20次重復試驗，95%置信區間，最后得5.0 ng/ml

線(xiàn)性

兩個(gè)人的血清樣本進(jìn)行稀釋檢測，結果如下，ng/ml

#	稀釋比例	檢測值	期望值	回收率%
1	1:10,000	21.9
	1:20,000	11.9	11.0	108
	1:40,000	5.3	5.5	96
	1:80,000	2.9	2.7	107
	1:160,000	1.6	1.4	114
2	1:10,000	192
	1:20,000	99.9	96	104
	1:40,000	45.2	48	94
	1:80,000	22.2	24	93
	1:160,000	13.4	12	112

精密度

兩個(gè)樣本在一個(gè)試驗中做20次重復檢測，分析板內差異

胎球蛋白A均值(ng/mL)	CV (%)
33.6	5.5
121.1	4.8

 
兩個(gè)樣本雙孔檢測，做了12次檢測，分析板間差異

胎球蛋白A均值(ng/mL)	CV (%)
32.4	6.8
123.7	5.7

4. 回收率
兩位患者血清加不同量的人胎球蛋白A ，檢測，結果如下，ng/ml

#	原始值	加入的量	檢測值	期望值	回收率%
1	33.6	21	25.1	27.3	92
		63	44.4	48.3	92
		200	120.1	116.8	103
2	121.1	21	68.9	71.1	97
		63	88.6	92.1	96
		200	157.1	160.6	98

本譯文由廣州健侖生物科技有限公司編譯，僅供參考，請以原說(shuō)明書(shū)為準或與我們公司工作人員聯(lián)系！