為保證及時(shí)、科學(xué)地采集、運送人粒細胞無(wú)形體病病例（包括疑似病例）及疫源地調查的各種類(lèi)型標本，規范人粒細胞無(wú)形體病的實(shí)驗室檢測程序，提高檢測質(zhì)量，為明確診斷或開(kāi)展相關(guān)的科學(xué)研究提供實(shí)驗室依據，特制定本方案。

一、樣本采集對象

（一） 人粒細胞無(wú)形體病病例（包括疑似病例，以下同）。

（二） 病例密切接觸者或其他健康人群。

（三） 疫源地可疑宿主動(dòng)物（野生動(dòng)物及狗、羊、牛等家畜）、媒介蜱。

二、標本種類(lèi)及采集方法

（一） 抗凝血。

常用EDTA抗凝管或枸櫞酸鹽抗凝管采集血液5ml，用于病原分離。應盡可能在病人使用抗生素前進(jìn)行血液的采集。

（二）非抗凝血。

用無(wú)菌真空管，采集病例、健康人群及宿主動(dòng)物非抗凝血5ml，用于血清抗體及PCR檢測。采集后，應及時(shí)分離血清，將血清、血球分別保存。急性期抗體及PCR檢測用血液采集盡可能在發(fā)病后1周內，恢復期抗體檢測標本采集至少間隔2-3周。如第2份血清在1個(gè)月之內抗體升高不明顯的，應建議間隔2-4周后采集第3份血液標本。

（三）包涵體檢測血涂片的制備。

采集血液標本后，制作厚血片，進(jìn)行紅細胞裂解處理等。

（四）媒介蜱標本的采集。

采集動(dòng)物體表媒介蜱，用鑷子夾取，放入鋪墊有潮濕濾紙或紗布的青霉素小瓶或試管中，用紗布包緊瓶口以防止蜱爬出。實(shí)驗室接到蜱標本后，首先應進(jìn)行種屬鑒定，然后按類(lèi)別分組（1-5只蜱/組），采用75%酒精浸泡30min后，用無(wú)菌蒸餾水反復沖洗3次。最后進(jìn)行分組研磨，研磨液用于提取DNA，進(jìn)行PCR擴增。

（五）有條件時(shí)，可采集活檢或尸檢標本，冰凍、福爾馬林固定或石蠟包埋后進(jìn)行實(shí)驗室檢測。具體方法參照病理實(shí)驗室相關(guān)要求和衛生部《傳染病人或疑似傳染病人尸體解剖查驗規定》的相關(guān)要求。

三、標本采集和保存注意事項

標本采集應符合無(wú)菌操作要求?？鼓绮荒芰⒓创策吔臃N，應置于4℃環(huán)境保存，避免冰凍（不超過(guò)2周）。非抗凝血應及時(shí)進(jìn)行無(wú)菌分離血清，血清用于抗體檢測，血球部分研磨后提取DNA用于PCR檢測。如不能及時(shí)檢測，可暫置于－20℃環(huán)境保存。所有標本應置入大小適合、帶螺旋蓋、內有墊圈的凍存管內，擰緊管口。

標本采集后，應認真填寫(xiě)采樣登記表。

四、實(shí)驗室檢測

（一）包涵體的檢測。

1. 血片及白細胞涂片制備

采集的抗凝血標本盡快用血球層推血片，待干燥后冷丙酮固定10min；或提取抗凝血中的白細胞并進(jìn)行涂片，待干燥后冷丙酮固定10min。

2. 染色

通常采用瑞氏（Wright）染色法、姬氏(Giemsa)染色法及瑞－姬混合染色法。有條件的實(shí)驗室，可使用美國CDC推薦的染色方法。

3. 染液配置方法

（1）瑞－姬染液：取瑞氏染料和姬氏染料各0.5 g，以甲醇研溶，加甲醇500ml保存，每天搖勻１次，１周后可使用。
    （2）改良Mc Donald法瑞－姬染色劑：75 ml甘油（分析純）中加入磷酸鹽緩沖液（Na₂HPO₄ 1g和KH₂PO₄ 2g），以4 ml蒸餾水溶解，37 ℃水浴24 h溶解混勻，用濾紙過(guò)濾，保存于密封的棕色瓶中備用。上述甘油緩沖液1.5 ml加瑞－姬染色劑50 ml，混勻后備用。

4. 染色步驟

血推片或白細胞涂片分別以?xún)煞N染色劑染色2 min，再加蒸餾水作用5 min，用自來(lái)水沖洗。
    5. 結果觀(guān)察

中性粒細胞中可見(jiàn)桑葚狀包涵體（見(jiàn)圖1），并注意保存相關(guān)標本，以便進(jìn)行復核。

（二）血清學(xué)檢測。

常用血清學(xué)方法為間接免疫熒光（IFA）法。采集急性期（發(fā)熱初期，一般發(fā)病1周內）與恢復期（至少間隔2-3周）雙份血清。如恢復期血清抗體檢測陰性，應建議醫生采集第3份血液樣本（間隔2-4周）。

1. 試劑 

使用國際推薦的、經(jīng)過(guò)ISO質(zhì)量認證的產(chǎn)品。

2. 方法及操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3. 結果解釋

IFA檢測結果解釋按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

如果同時(shí)檢測雙份血清，IgG抗體4倍升高，則結果強烈支持嗜吞噬細胞無(wú)形體感染。如果急性期抗體升高，而恢復期沒(méi)有升高或輕微升高，則應采集第3份血液樣本（間隔2-4周）進(jìn)行進(jìn)一步檢測。

（三）嗜粒細胞無(wú)形體核酸PCR檢測。

目前，國際推薦使用16S rRNA基因檢測方法，有條件的實(shí)驗室，可進(jìn)一步選用熱休克蛋白基因groEL擴增方法。

1. DNA提取

用急性期、未使用抗生素的EDTA抗凝血或非抗凝血血球部分、白細胞及蜱研磨液提取DNA。最后，以AE緩沖液50μl抽濾以提高回收的DNA濃度。如采用血液白細胞層提取DNA，可明顯提高陽(yáng)性檢出率。實(shí)驗時(shí)，應采集當地正常人血液同時(shí)提取DNA，作為PCR的陰性對照。

2. PCR擴增

（1）16S rRNA基因檢測：16S rRNA 高度保守，是PCR檢測最常用的擴增靶基因，巢式PCR檢測可提高檢測靈敏度和特異度，采用屬特異及種特異引物同時(shí)進(jìn)行檢測。PCR檢測應分區進(jìn)行，避免污染。使用引物序列見(jiàn)表1。

表1  巢式PCR檢測無(wú)形體及埃立克體16S rRNA基因常用引物

引物名稱(chēng)	序 列	片段長(cháng)度(bp)
Eh-out1(AF414399)	5’-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3’	653
Eh-out2(AF414399)	5’-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3’
Eh-gs1(AF414399)	5’-GTA ATA CT GTA TAA TCC CTG-3’	282
Eh-gs2(AF414399)	5’-GTA CCG TCA TTA TCT TCC CTA-3’
HGA1	5’-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG -3’	389
HGA2	5’-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3’

 

PCR反應混合物的準備按常規進(jìn)行。第一輪反應采用外引物對Eh-out1和Eh-out2，DNA模板10μl（白細胞提取的DNA可適當減少）。PCR反應體系總體積為25μl或50μl（需要進(jìn)行PCR測序或克隆時(shí)，應適當擴大反應體系），其它成分的濃度按常規進(jìn)行。反應程序如下：

94℃  5min

40循環(huán)：94℃  45sec

        55℃  50sec

        72℃  1min

72℃  總延伸 5min

第二輪反應使用2對引物分別進(jìn)行巢式PCR。2對引物分別是無(wú)形體屬及埃立克體屬通用內引物（Eh-gs1、Eh-gs2）；以及HGA種特異性引物（HGA1及HGA2）。檢測樣本取第一輪產(chǎn)物1-2μl為模板，陽(yáng)性對照取0.5μl為模板。反應程序同第一輪反應。

（2）熱休克蛋白基因groEL擴增

與groEL基因的應用相比，16S rRNA基因的應用更為廣泛，但groEL基因在不同種屬間具有較大的變異性。因此，對于診斷及菌株的鑒定，groEL基因均具有重要意義。該基因擴增使用巢式PCR，引物序列見(jiàn)表2。

表2  groEL基因擴增常用引物   

引物名稱(chēng)	序  列	退火溫度	片段長(cháng)度bp)
HS1	5’-TGG GCT GGT  A（A/C）TGA AAT	52℃	1431
HS6	5’-CCI CCI GGI ACI  A（C/T）ACC TTC
HS43	5’-AT（A/T）GC（A/T） AA（G/A）GAA GCA TAG TC	55℃	HGA480
HS45	5’-ACT TCA CG（C/T）（C/T）TCA TAG AC		HME528

DNA提取同上。PCR檢測時(shí)，反應混合物的準備按常規進(jìn)行。DNA模板量同16S rRNA基因檢測。巢式PCR第一輪反應采用外引物對HS1及HS6。

反應程序如下：

 3循環(huán)：94℃ 1min

         48℃ 2min

         70℃ 90sec

37循環(huán)：88℃ 1min

          52℃ 2min

          70℃ 90sec

 68℃ 總延伸 5min

第二輪PCR引物采用HS43及HS45。檢測樣本取第一輪產(chǎn)物1-2μl為模板，陽(yáng)性對照取0.5μl為模板。反應程序同第一輪反應。反應程序同第一輪反應，但退火溫度由52℃改為55℃。

3．測序及分析

對擴增產(chǎn)物進(jìn)行測序并進(jìn)行同源比較，分析當地流行株與其它地區的變異性。

（四）病原體分離培養。

多用HL-60進(jìn)行嗜吞噬細胞無(wú)形體的分離培養。最常用的分離方法是將白細胞部分接種培養基，然后將100-500μl抗凝血接種到懸浮有2×10⁵或1×10⁶細胞內, 每2-3天染色檢查包涵體，一般5-10天可查見(jiàn)包涵體。由于分離可能受到紅細胞的影響，因此，建議使用以下方法：

1.白細胞分離：采用密度梯度離心方法（Ficoll-Paque）。一般采用2-3 ml EDTA抗凝血，用2倍體積的無(wú)菌Hanks 平衡鹽溶液稀釋?zhuān)詈蟛捎?/span>Histopaque（Sigma，St . louis, Mo）密度梯度離心分離白細胞，可以獲得較高的白細胞，用以分離HGA。采用白細胞分離方法進(jìn)行接種時(shí)，應注意防止操作過(guò)程中的污染。

2. 紅細胞裂解后收集白細胞（NHCl₄裂解法）。

3. 在使用含有紅細胞的標本培養后，另加入宿主未感染的細胞，建立混合培養。

血液白細胞懸浮于2ml體積、含有5-10%胎牛血清的培養基中，且在25 cm²培養瓶?jì)扰c培養細胞作用3小時(shí)。37℃、5% CO₂ 條件下振搖孵育，可增加病原體與細胞的作用。

病原體的鑒定：可通過(guò)種特異引物進(jìn)行PCR鑒定。

五、生物安全

在標本采集、運輸及實(shí)驗室工作過(guò)程中，生物安全應參照《病原微生物實(shí)驗室生物安全管理條例》中的有關(guān)要求進(jìn)行。

（一）實(shí)驗室生物安全。

標本滅活、病原DNA標本提取及病原體分離操作應在生物安全Ⅱ級實(shí)驗室進(jìn)行。非感染性材料的檢測可在生物安全I級實(shí)驗室進(jìn)行。

（二）血液標本采集安全注意事項。

采集病例的標本時(shí)，應做好個(gè)人防護。采集者應戴乳膠手套，盡量避免病例的血液外溢或直接接觸。如發(fā)生血液外溢污染環(huán)境時(shí)，應及時(shí)采用75%酒精或常用消毒劑進(jìn)行消毒處理。應按照對傳染性樣本的要求，對采集標本的器具及病人止血棉球及時(shí)進(jìn)行消毒處理。防止銳器扎傷皮膚，一旦發(fā)生，應按臨床外科要求，及時(shí)進(jìn)行傷口清創(chuàng )。如直接沾染了臨床診斷病例或確診病例的血液，除及時(shí)消毒皮膚外，應口服強力霉素預防感染，服用劑量參照《人粒細胞無(wú)形體病診療方案（試行）》（附件1）。

（三）采集動(dòng)物宿主與媒介蜱標本個(gè)人防護。

野外采集標本時(shí)，應穿著(zhù)顏色明亮的防護服，并將衣袖或褲管口扎緊以防蜱叮咬人體，且容易發(fā)現蜱的附著(zhù)。一旦發(fā)現有蜱附著(zhù)體表，應用鑷子夾取，不要用手直接摘除。野外作業(yè)或活動(dòng)的人員可使用驅避劑或防蚊油噴涂皮膚，也可用硫化鉀代替防蚊油。

（四）標本運輸安全注意事項。

應參照《病原微生物實(shí)驗室生物安全管理條例》中的有關(guān)要求（B類(lèi)）進(jìn)行。

（五）在診療及標本的采集、包裝和實(shí)驗室檢測等過(guò)程中所產(chǎn)生的醫療廢物，應按照《醫療廢物管理條例》和《醫療衛生機構醫療廢物管理辦法》等相關(guān)規定處理。