1.  目的

根據國家標準ws216-2008，規范本中心登革熱IgM抗體的檢測。

2.  適用范圍

2.1  適用于血清或血漿中登革熱IgM抗體的檢測。

3.  職責

檢測人員：負責按照本檢測細則對被測樣品進(jìn)行檢測。

復核人員：負責對檢測操作是否規范以及檢測結果是否準確進(jìn)行復核。

科室負責人：負責對檢測操作的監督和檢測結果的審核。

4.  規程：親和素-生物素法檢測登革熱IgM抗體。

4.1  原理：在微孔條上包被生物素化抗原，配以酶標記抗人IgM單克隆抗體作為標記抗原及TMB顯色劑等其它試劑，采用親和素-生物素法檢測登革熱IgM抗體。

4.2  試劑

4.2.1  生物素化抗原預包被板

4.2.2  陰性、陽(yáng)性對照

4.2.3  酶結合物

4.2.4  30X濃縮洗滌液。（用蒸餾水1：30稀釋使用）

4.2.5  顯色劑A、B液。

4.2.6  終止液。

4.2.7  封片。

4.3  儀器與設備

4.3.1  20-200μL可調移液器。

4.3.2  電熱恒溫水溫箱。

4.3.3  微量振蕩器。

4.3.4  洗板機、酶標儀。

4.4  操作步驟

參照試劑盒說(shuō)明書(shū)或按以下步驟操作。

4.4.1  將試劑盒平衡至室溫后取出反應板拆封。

4.4.2  加樣：將待檢標本用標本稀釋液1：41稀釋?zhuān)?/span>5ul-200ul）,于反應板中加稀釋好的待檢標本及陰陽(yáng)對照各100ul/孔，設空白對照一孔（不加任何液體），輕輕混勻。37℃溫育30分鐘。

4.4.3  甩去孔內液體，用洗滌液洗板3次并拍干。

4.4.4  加酶結合物：每孔2滴，混勻后置37℃溫育30分鐘。

4.4.5  同4.4.3步驟。

4.4.6  顯色：每孔加顯色劑A、B各一滴，用震蕩器混勻，后置37℃溫育10分鐘

4.4.7  用酶標儀讀數，取波長(cháng)450nm，先用空白孔校零，然后讀取各孔OD值。

4.4.8  結果判斷

4.4.8.1  P/N=標本OD值/陰性對照OD值

4.4.8.2  P/N≥2.1為陽(yáng)性；

 

4.4.8.3  1.5≤P/N<2.1 為可疑標本；P/N<1.5為陰性。

4.4.8.4  陰性對照（NC）小于0.10時(shí)以0.10計，大于0.1小于0.21時(shí)以實(shí)際OD值計算；若大于0.21時(shí)，實(shí)驗可能出現了較大誤差，需重復實(shí)驗。

4.4.8.5  陽(yáng)性對照（PC）值≥0.4，實(shí)驗成立，否則需重做。

4.6  注意事項

4.6.1  從冷藏環(huán)境中取出的試劑盒內全部瓶裝試劑及待測標本所需微孔反應條應置37℃平衡30分鐘后方可使用，余者應及時(shí)封存于冰箱中以備后用。在平衡試劑的同時(shí)，待測標本需置室溫平衡30分鐘后再行測試。

4.6.2  使用前試劑應搖勻，并棄去1～2滴后垂直滴加。

4.6.3  封片不能重復使用。

4.6.4  結果判斷須在反應終止后10分鐘內完成。

4.6.5  不同批號的試劑不可混用。

4.6.6  待測標本不可用NaN₃防腐，如需稀釋標本，請用小牛血清稀釋。

4.6.7  洗滌時(shí)每孔均須加滿(mǎn)，防止孔內有游離酶不能洗凈。

4.6.8  避免用溶血、混濁或脂血標本。