森林腦炎IgG檢測試劑盒(ELISA)說(shuō)明書(shū)

【預期用途】

本試劑盒可用于定量檢測人血清血漿和腦脊髓液中的抗腦炎病毒（TEBV）的IgG抗體，從而控制體液免疫狀態(tài)和確定疫苗接種后的血清轉化。鑒別明顯的和潛在的腦炎病毒的感染，通常附帶著(zhù)抗腦炎病毒的IgM的檢測。

【臨床背景】

在歐洲，森林腦炎和萊姆病是最為常見(jiàn)的蜱媒傳染病。萊姆病分布非常廣泛，但森林腦炎只存在于一些特殊的地方（德國南部、圖林根州、奧地利、瑞士、匈牙利、瑞典、捷克、斯洛伐克共和國、克羅地亞、斯洛文尼亞以及一些前蘇聯(lián)地區等。）。

這兩種病的感染都跟它們的發(fā)育類(lèi)似，包含兩個(gè)或兩個(gè)以上的階段。森林腦炎的病毒血癥階段含有3~14天的孵育階段，在此階段的初期（1-8天） 會(huì )出現類(lèi)似流行性感冒的癥狀。在大概一周沒(méi)發(fā)熱的間隔后，感染進(jìn)入第二階段，以神經(jīng)系統方面的癥狀強度的改變?yōu)樘卣?，這種階段可能持續幾周時(shí)間。

在疾病第二階段的初期，通?？梢詸z測到抗森林腦炎的IgM抗體?？贵w水平在2~6周后達到峰值?？贵w水平要降低到可檢測以下可能需要10個(gè)月時(shí) 間?？股帜X炎的IgG抗體在IgM抗體出現的同時(shí)或者之后幾天內即可檢測到。感染意味著(zhù)出現通常能維持一生的免疫力。接種疫苗也能預防疾病。

腦脊髓液中的森林腦炎特異性抗體可能是在對森林腦炎抗原進(jìn)行免疫應答時(shí)或者之前由血腦屏障的功能紊亂引起的，又或者是局部的免疫應答引起的。所以，腦脊髓液中抗體水平的波動(dòng)可能跟這些一般在血清或血漿中的抗體水平不一樣。

由于添加了RF/IgG吸附劑所以RF因子和特異性IgG不會(huì )干涉IgM的檢測。這兩種檢測系統的結合可以用于森林腦炎疫苗接種后的體液免疫隨訪(fǎng)或者感染，早期的森林腦炎感染和監測人血清、血漿和腦脊髓液中的抗體水平。

【檢測原理】

本試劑盒使用的是兩步法ELISA。微孔中包被了失活的森林腦炎病毒。稀釋后的血清、血漿或者腦脊髓液樣本在微孔中孵育。孵育期間，森林腦炎特 異性抗體會(huì )跟森林腦炎病毒相集合，未結合的部分通過(guò)洗板洗去。加入酶聯(lián)物進(jìn)行孵育，HRP標記的抗人IgG抗體會(huì )跟人IgG抗體特異性結合。加入底物液后 顏色轉變成藍色，孵育一段時(shí)間后加入終止液終止反應，顏色從藍色轉換成黃色，最后在酶標儀上讀數。

【儲存和穩定性】

此試劑盒在室溫發(fā)貨，儲存在2 – 8℃。避免高溫或太陽(yáng)光直射。樣本和準備好的試劑的儲存和穩定性在相應的章節都有闡明。包被板條在有效期內都能保持穩定，儲存在2 – 8℃下時(shí)應和干燥劑一起密封在小袋中。

【樣本采集和儲存】

血清、血漿或者腦脊髓液

遵守靜脈穿刺的一般規定，從收集到實(shí)驗期間，保存樣本化學(xué)性質(zhì)的完整是非常重要的，注意不要使用溶血的、脂血、黃疸的樣本，樣本出現渾濁應該在實(shí)驗前離心并去除所有的微粒物質(zhì)。
儲存	2~8℃	≤-20℃（小瓶分裝）	避免高溫和陽(yáng)光直射，避免反復凍融
穩定性	5d	12個(gè)月

【試劑組成】

數量	標識	組分
1×12×8	MTP	包被板 即用，可拆分，包被了已滅活的TBE病毒
2×75mL	DILBUF	稀釋緩沖液 即用，紅色
1×0.6mL	ENZCONJ CONC	酶聯(lián)物 藍色，酶標記的抗人IgG抗體
5×0.35mL	CAL 1-5	濃縮校準品 含人血清，穩定劑，防腐劑 濃縮的倍數以不同的批號而不同，具體請參照瓶上的標簽
2×0.35mL	Control LL Control HL	質(zhì)控LL+HL 濃縮 陽(yáng)性質(zhì)控血清，LL“低水平”HL“高水平” 含：人血清，穩定劑，防腐劑。 濃縮的倍數以不同的批號而不同，具體請參照瓶上的標簽
1×100mL	WASHBUF CONC	洗滌液，10倍濃縮 含磷酸鹽緩沖液
2×12mL	TMB SUBS	TMB底物液 即用，含TMB
1×12mL	TMB STOP	TMB終止液 即用，含0.5M 硫酸
2×	FOIL	封板片

【試驗需要但試劑盒不提供的設備】

1.         一次性使用的5;25;50;100;500μl加樣槍頭

2.         漩渦混勻器

3.         樣品稀釋管

4.         軌道振蕩器（200-900rpm）

5.         8道微量移液器和加樣槽。

6.         洗瓶，自動(dòng)化或半自動(dòng)化的洗板機

7.         450nm的酶標儀

8.         雙蒸水或去離子水

9.         紙巾，移液管，計時(shí)器

【實(shí)驗前準備】

1.       濃縮試劑的準備（用于32孔的例子）

稀釋/溶解	組分	加入稀釋液的量	稀釋液	比例	附注	儲存	穩定性
80μL	ENZCONJ CONC	8mL	DILBUF	1:101	仔細混勻	18-25℃	1小時(shí)
10mL	WASHBUF CONC	90mL	蒸餾水	1:10	仔細混勻	2-8℃	2個(gè)月

2.       標準品、質(zhì)控品和樣本的稀釋

	稀釋方法	稀釋液	稀釋比例	備注
CAL 1-5 Control LL Control HL	常規稀釋	DILBUF	1：101	例子：10μL 校準品/質(zhì)控品+1000μL
血清、血漿	常規稀釋	DILBUF	1:101	例子：10μL樣本+1000μL
腦脊髓液	常規稀釋	DILBUF	1:9	例子：50μL樣本+400μL

用于標準曲線(xiàn)方法需要1~5校準品和指控血清；樣本所含的濃度如果高于最高校準品濃度需要進(jìn)一步稀釋。用于一點(diǎn)標定法則只需要校準品4和質(zhì)控血清即可。

【實(shí)驗步驟】

1.       將200μL已稀釋的校準品、質(zhì)控品和樣本加到相應的微孔中。

2.       用封板片封板，室溫下（18-25℃）孵育1小時(shí)

3.       揭去封板片，棄去反應液，用稀釋后的洗滌液洗板3次（250μL/孔/次），最后通過(guò)拍板拍去殘留的液體

4.       將200μL已稀釋的酶聯(lián)物加到每個(gè)孔中

5.       用封板片封板，在室溫下（18-25℃）孵育1小時(shí)

6.       重復步驟3

7.       將200μL  TMB底物液加到每個(gè)孔中

8.       室溫(18-25℃)孵育30分鐘

9.       按加TMB底物液的順序，將50μL的終止液加到每個(gè)孔中，輕輕混勻

10.   在加入終止液后10分鐘內，用酶標儀在450nm±10nm處讀數。

【結果的計算】

1.       標準曲線(xiàn)方法

在半對數紙上（或者使用自動(dòng)化儀器）以每個(gè)標準品的OD值為Y軸，相應的濃度為X軸做出標準曲線(xiàn)，推薦使用4參數邏輯函數（Y=d+(a-b)/(1+(x/c)^b)）。

樣本的濃度應當直接從標準曲線(xiàn)中讀取，如果有稀釋?zhuān)瑒t在計算中應該乘以稀釋倍數，如果樣本的濃度過(guò)高，則需要按照實(shí)驗前設置說(shuō)明稀釋樣本。

2.       一點(diǎn)標定法

（1）       樣本濃度的手冊檢測

需要使用用校準品4、質(zhì)控血清和樣本各自的平均OD值。校準品4的OD必須要在指定的范圍內（見(jiàn)一點(diǎn)標定法評估表）。每次檢測都必須計算檢測特殊的校正因子。校準品4的理論OD值都是按特定批次檢測得出的（見(jiàn)一點(diǎn)標定法評估表）。將質(zhì)控血清和樣本的OD乘以校正因子：

質(zhì)控血清和樣本濃度可以從批次參考曲線(xiàn)中讀出。

例子：

校準品4的理論OD值                  OD=1.377

校準品4的檢測OD值                  OD=1.273

校正因子F                             F=1.082

樣本的檢測OD值                      OD=0.937

樣本的校正OD值                      OD=1.014

讀取濃度                         0.5VIEU/mL

（2）       腦脊髓液樣本濃度的計算（一點(diǎn)標定法軟件）

打開(kāi)名為“One Point Calibration TBE IgG Liquor”的Excel文件，將QC證書(shū)的下列指標填到Excel中：

校準品4的理論OD值

校準品4的OD范圍

臨界1和臨界2的理論OD值

臨界1 OD=灰區的最低點(diǎn)

臨界2 OD=灰區的最高點(diǎn)

填入檢測到的校準品4平均OD，將腦脊髓液樣本的鑒別和OD插入到已準備好的計算單中。腦脊髓液樣本的求值和OD都會(huì )自動(dòng)完成。

【結果的判定】

血清/血漿

＜63VIEU/mL         陰性

63-126VIEU/mL       灰區

＞126VIEU/mL        陽(yáng)性

腦脊髓液

OD＜臨界1理論OD                      陰性

臨界1理論OD＜OD＜臨界2理論OD       灰區

OD＞臨界2理論OD                      陽(yáng)性

【結果的說(shuō)明】

1.       疫苗

通過(guò)檢測血清血漿中的抗TBE的IgG抗體來(lái)證明血清轉化

（1）       抗TBE IgG陰性

接種疫苗后無(wú)血清轉化

（2）       抗TBE IgG 灰區

可能有血清轉化，建議在2~4周內再次檢測

（3）       抗TBE IgG陽(yáng)性

接種疫苗后有血清轉化

2.       感染

（1）       抗TBE IgM和抗TBE IgG 陰性    

無(wú)感染

（2）       抗TBE IgM陰性和TBE IgG 陽(yáng)性  

這可能是潛在的免疫或者是幾周或幾月之前的感染

（3）       抗TBE IgM陽(yáng)性和TBE IgG陰性

可能有新近感染

（4）       抗TBE IgM和抗TBE IgG都陽(yáng)性

有感染

本譯文由廣州健侖生物科技有限公司技術(shù)人員編譯，僅供參考，詳情請與我們聯(lián)系。