逆轉錄PCR

RT-PCR即逆轉錄PCR。

RT-PCR 為反轉錄PCR（reverse transcription PCR）和實(shí)時(shí)PCR（real time PCR）共同的縮寫(xiě)。逆轉錄PCR，或者稱(chēng)反轉錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA，再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴增。

1mode逆轉錄PCR

由一條RNA單鏈轉錄為互補DNA(cDNA)稱(chēng)作“逆轉錄”，由依賴(lài)RNA的DNA聚合酶（逆轉錄酶）來(lái)完成。隨后，DNA的另一條鏈通過(guò)脫氧核苷酸引物和依賴(lài)DNA的DNA聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互補DNA。

RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術(shù)，可以檢測很低拷貝數的RNA。RT-PCR廣泛應用于遺傳病的診斷，并且可以用于定量監測某種RNA的含量。（檢測基因表達的方法，參見(jiàn)Northern Blot法。

RT-PCR的關(guān)鍵步驟是在RNA的反轉錄，要求RNA模版為完整的且不含DNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。常用的反轉錄酶有兩種，即鳥(niǎo)類(lèi)成髓細胞性白細胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反轉錄酶和莫羅尼鼠類(lèi)白血病病毒（moloney murine leukemia virus,MMLV）反轉錄酶。

RT-PCR有時(shí)候也會(huì )指代實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)。為了與逆轉錄PCR相區別，通常被寫(xiě)作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。

2實(shí)時(shí)PCR

實(shí)時(shí)PCR(real-time PCR)，屬于定量PCR（Q-PCR）的一種，以一定時(shí)間內DNA的增幅量為基礎進(jìn)行DNA的定量分析。

real time PCR 的定量使用熒光色素，目前有二種方法。一種是在ds DNA中插入特異的熒光色素，例如SYBR Green熒光染料；另一種使用一種能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結合的一種熒光探針（probe），如Taqman探針。兩種方法原理不同。SYBR Green熒光染料游離時(shí)不發(fā)光，當反應體系中存在雙鏈DNA時(shí)，SYBR Green與雙鏈DNA結合，此時(shí)才發(fā)光。Taqman探針帶有一個(gè)熒光基團和一個(gè)淬滅基團，熒光基團連接在探針的5’末端，而淬滅基團則在3’末端。PCR擴增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，探針完整時(shí)，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，此時(shí)熒光基團發(fā)出的熒光信號可以被檢測到。

real time PCR 與 reverse transcription PCR 相結合，能用微量的RNA來(lái)找出特定時(shí)間、細胞、組織內的特別表達的遺傳基因。這兩種RT PCR的組合又被稱(chēng)之為“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”

3RT-PCR技術(shù)相關(guān)試劑

oligo: 多聚體，相當于mRNA引物

AMV RT：禽類(lèi)成髓細胞瘤病毒逆轉錄酶

MMLV RT：莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶

dNTPs：脫氧核苷酸

RNase：RNA水解酶

PCR Buffer：RT-PCR緩沖液

MgCl2：2價(jià)鎂離子

PCR各步驟的目的

預變性

破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級結構。使DNA充分變性，減少DNA 復雜結構對擴增的影響，以利于引物更好的和模板結合，特別是對于基因組來(lái)源的DNA模板，最好不要吝嗇這個(gè)步驟。此外，在一些使用熱啟動(dòng)Taq酶的反應中，還可激活Taq酶，從而使PCR反應得以順利進(jìn)行。

三種循環(huán)

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

延伸時(shí)間原因

用PCR儀擴增時(shí),(變性.退火,延伸)循環(huán)完成后,繼續72度延伸了10分鐘的原因：

1.延伸時(shí)間取決于待擴增DNA片段的長(cháng)度。（當然是在反應體系一定的條件下）例如，使用TaqDNA聚合酶，72度時(shí)的堿基摻入率為35-100bp/s，因此延伸速率為1kb/min。

2.根據延伸速率推得，擴增1kb以?xún)鹊腄NA片段1min即可，而3-4kb則需要3-4min，依次照推。通常在最后一輪要適當的將延伸時(shí)間延長(cháng)至4-10min，這樣做是使PCR反應完全以提高擴增產(chǎn)量。

3.繼續72度延伸了10分鐘除了可以使PCR反應完全以提高擴增產(chǎn)量外，還有一個(gè)作用是：在用普通Taq酶進(jìn)行PCR擴增時(shí)在產(chǎn)物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的進(jìn)行。

PCR引物的選擇

對靶序列中潛在的引物位點(diǎn)進(jìn)行分析， 這些位點(diǎn)應該不會(huì )形成同源多聚體機構，也沒(méi)有明顯的形成二級結構的趨勢，不會(huì )自身互補，與基因組中的其他序列無(wú)顯著(zhù)的同源性。

（1）依據寡核苷酸引物與其靶序列形成雜合分子的熔解度的計算中提供的公式計算各引物的熔解溫度。

（2）選擇一對匹配完好的正向和反向引物。兩條引物的G+C含量相似，將產(chǎn)生一種大小和堿基組成合適的產(chǎn)物。兩條引物與所擴增片段的GC含量都應在40%-60%之間。

（3）對寡核苷酸的長(cháng)度和/或位置進(jìn)行細調。使得引物的3‘末端核苷酸為G或C。檢查兩條寡核苷酸之間有無(wú)明顯的互補性。作為一條經(jīng)驗性的規律，一條引物上不該含有三個(gè)連續的與另一條引物互補的核苷酸。

注意事項

(1)雙鏈DNA的變性溫度是由雙鏈中C+G的含量決定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解溫度就越高。在選擇的變性溫度下，模板鏈越長(cháng)變性所需時(shí)間就越長(cháng)。如果變性溫度過(guò)低或變性時(shí)間過(guò)短，會(huì )使僅僅富含A+T區域變性。當模板DNA的G+C含量超過(guò)55%的時(shí)需要更高的變性溫度。

(2) 復性過(guò)程采用的溫度至關(guān)重要如果復性溫度太高，寡核苷酸引物不能與模板很好的復性，擴增效率將會(huì )降低。如果復性溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復性，從而導致非特異性的DNA片段的擴增。復性通常在比理論計算的引物和模板的溶解溫度低3—5℃的條件下進(jìn)行。

（3）PCR擴增所需的循環(huán)數目決定于反應體系中起始的模板拷貝數以及引物延伸和擴增的效率。一旦PCR反應進(jìn)入幾何級數的增長(cháng)期，反應會(huì )一直持續下去，直至某一成分成為限制因素。從這一點(diǎn)上來(lái)說(shuō)，擴增產(chǎn)物中絕大多數應該是特異性的擴增產(chǎn)物，而非特異性的擴增產(chǎn)物應該低到難以檢測到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率為0.7）在一個(gè)含有10的5次方個(gè)拷貝的靶序列的反應體系中進(jìn)行30個(gè)循環(huán)后往往可以做到上述的理想情況。