手足口病（Hand-foot-mouth Disease, HFMD）是由多種人腸道病毒引起的一種兒童常見(jiàn)傳染病，是我國法定報告管理的丙類(lèi)傳染病。大多數患者癥狀輕微，以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要癥狀。少數患者可出現無(wú)菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、神經(jīng)源性肺水腫和心肌炎等，個(gè)別重癥患兒病情進(jìn)展快，可導致死亡。手足口病常出現暴發(fā)或流行，為指導各地做好手足口病的預防控制工作，制定本指南。

　　一、目的

　?。ㄒ唬┲笇пt療機構、疾病預防控制機構開(kāi)展疫情報告與監測。

　?。ǘ┲笇Ъ膊☆A防控制機構開(kāi)展流行病學(xué)調查、病原學(xué)監測。

　?。ㄈ┲笇Ъ膊☆A防控制機構、醫療機構開(kāi)展重點(diǎn)場(chǎng)所及公眾預防控制工作。

　　二、疾病概述

　?。ㄒ唬┎≡瓕W(xué)。

　　引起手足口病的病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，包括柯薩奇病毒A組（Coxasckievirus A, CVA）的 2、4、5、7、9、10、16 型等，B組（Coxasckievirus B, CVB)的1、2、3、4、5 型等；腸道病毒71型（Human Enterovirus 71, EV71）；?？刹《荆‥chovirus, ECHO）等。其中以EV71及CVA16型較為常見(jiàn)。

　　腸道病毒適合在濕、熱的環(huán)境下生存與傳播，75%酒精和5%來(lái)蘇不能將其滅活，對乙醚、去氯膽酸鹽等不敏感；對紫外線(xiàn)和干燥敏感，各種氧化劑(高錳酸鉀、漂白粉等)、甲醛、碘酒以及56℃30分鐘可以滅活病毒。病毒在4℃可存活1年，-20℃可長(cháng)期保存，在外環(huán)境中可長(cháng)期存活。

　?。ǘ┝餍胁W(xué)。

　　1．傳染源。人是人腸道病毒的唯一宿主，患者和隱性感染者均為本病的傳染源，隱性感染者難以鑒別和發(fā)現。發(fā)病前數天，感染者咽部與糞便就可檢出病毒，通常以發(fā)病后一周內傳染性最強。

　　2．傳播途徑。腸道病毒可經(jīng)胃腸道（糞-口途徑）傳播，也可經(jīng)呼吸道（飛沫、咳嗽、打噴嚏等）傳播，亦可因接觸患者口鼻分泌物、皮膚或粘膜皰疹液及被污染的手及物品等造成傳播。尚不能明確是否可經(jīng)水或食物傳播。

　　3．易感性。人對人腸道病毒普遍易感。不同年齡組均可感染發(fā)病，以5歲及以下兒童為主，尤以3歲及以下兒童發(fā)病率最高。顯性感染和隱性感染后均可獲得特異性免疫力，產(chǎn)生的中和抗體可在體內存留較長(cháng)時(shí)間，對同血清型病毒產(chǎn)生比較牢固的免疫力，但不同血清型間鮮有交叉免疫。

　　4．流行特征。該病流行無(wú)明顯的地區性，全年均可發(fā)生，一般5-7月為發(fā)病高峰。托幼機構等易感人群集中單位可發(fā)生暴發(fā)。腸道病毒傳染性強、隱性感染比例大、傳播途徑復雜、傳播速度快，控制難度大，容易出現暴發(fā)和短時(shí)間內較大范圍流行。

　?。ㄈ┡R床表現。

　　手足口病潛伏期為2-10天，平均3-5天，病程一般為7-10天。

　　急性起病，發(fā)熱，口腔粘膜出現散在皰疹，手、足和臀部出現斑丘疹、皰疹，皰疹周?chē)捎醒仔约t暈，皰內液體較少?？砂橛锌人?、流涕、食欲不振等癥狀。部分患者無(wú)發(fā)熱，僅表現為皮疹或皰疹。一般預后良好；少數病例，特別是EV71感染患兒，可出現腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎、神經(jīng)源性肺水腫、循環(huán)障礙等，病情兇險，可致死亡或留有后遺癥。

　?。ㄋ模┲委熢瓌t。

　　目前無(wú)特異性治療方法，以支持療法為主，絕大多數患者可自愈。目前尚無(wú)特異性的疫苗。病例的治療方法參考衛生部《手足口病診療指南（2008年版）》。

　　三、病例定義

　?。ㄒ唬┡R床診斷病例。

　　在流行季節發(fā)病，常見(jiàn)于學(xué)齡前兒童，嬰幼兒多見(jiàn)。

　　1．普通病例：發(fā)熱伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可無(wú)發(fā)熱。

　　2．重癥病例：出現神經(jīng)系統受累、呼吸及循環(huán)功能障礙等表現，實(shí)驗室檢查可有外周血白細胞增高、腦脊液異常、血糖增高，腦電圖、腦脊髓磁共振、胸部X線(xiàn)、超聲心動(dòng)圖檢查可有異常。

　　極少數重癥病例皮疹不典型，臨床診斷困難，需結合實(shí)驗室檢測做出診斷。

　　若無(wú)皮疹，臨床不宜診斷為手足口病。

　?。ǘ?shí)驗室確診病例。

　　臨床診斷病例符合下列條件之一者，即可診斷為實(shí)驗室確診病例：

　　1．自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子、腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾、淋巴結等組織標本中分離到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有明確證據表明可以導致手足口病的人腸道病毒）。

　　2．自咽拭子或咽喉洗液、糞便或肛拭子等標本中檢測到CVA16 或EV71特異性核酸，或從腦脊液、皰疹液、血清以及腦、肺、脾、淋巴結等組織標本等標本中檢測到人腸道病毒（指包括CVA16和EV71等有明確證據表明可以導致手足口病的人腸道病毒）的特異性核酸。

　　3．血清標本人腸道病毒型特異性中和抗體滴度≥1∶256，或急性期與恢復期血清腸道病毒特異性中和抗體有4倍或4倍以上的升高。

　?。ㄈ┚奂圆±?。

　　1周內，同一托幼機構或學(xué)校等集體單位發(fā)生5例及以上手足口病病例；或同一班級（或宿舍）發(fā)生2例及以上手足口病病例；或同一自然村發(fā)生3例及以上手足口病病例；或同一家庭發(fā)生2例及以上手足口病病例。

　　四、疾病監測

　?。ㄒ唬┮咔閳蟾?。

　　1．個(gè)案報告。各級各類(lèi)醫療機構應按照《中華人民共和國傳染病防治法》和《傳染病信息報告管理規范》的有關(guān)規定，對符合病例定義的手足口病病例進(jìn)行報告。

　　如為重癥病例，請在“重癥患者”處選擇“是”；如為實(shí)驗室診斷病例，請在“實(shí)驗室結果”處選擇相應的腸道病毒病原學(xué)分型信息。

　　實(shí)行網(wǎng)絡(luò )直報的醫療機構應于24小時(shí)內進(jìn)行網(wǎng)絡(luò )直報，未實(shí)行網(wǎng)絡(luò )直報的醫療機構應于24小時(shí)之內寄送出傳染病報告卡。

　　2．聚集性病例報告。托幼機構和學(xué)校、醫療機構發(fā)現手足口病聚集性病例時(shí)，應以最快的方式向縣（區）級疾病預防控制機構報告。

　　3. 突發(fā)公共衛生事件報告。局部地區或集體單位發(fā)生流行或暴發(fā)時(shí)，按照《突發(fā)公共衛生事件應急條例》、《全國突發(fā)公共衛生事件應急預案》、《突發(fā)公共衛生事件與傳染病疫情監測信息報告管理辦法》及有關(guān)規定，及時(shí)進(jìn)行突發(fā)公共衛生事件信息報告。

　?。ǘ┎≡瓕W(xué)監測。

　　各省區市衛生行政部門(mén)要組織醫療衛生機構開(kāi)展病原學(xué)監測，了解病原動(dòng)態(tài)分布變化。所有重癥和死亡病例均需采樣。此外，以縣（區）為單位，每月最少需采集5例首次就診的普通病例標本；當月縣（區）病例總數少于5例時(shí)，全部采樣。

　　以?。▍^、市）為單位,在手足口病流行年份中每年至少采集20對EV71 和10對CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清,以闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動(dòng)態(tài)變化，評價(jià)血清學(xué)抗體試劑盒的敏感性和特異性。

　　以?。▍^、市）為單位，每月至少從手足口病病例中分離10株毒株并做血清型別鑒定，鑒定完成后并將毒株及鑒定結果于5個(gè)工作日內報送至中國疾病預防控制中心。具備測序條件的省份，可開(kāi)展VP1基因序列測定和分析，進(jìn)行基因定型，序列測定完成后將序列結果于5個(gè)工作日內報送至中國疾病預防控制中心；不具備測序條件者，將毒株送至中國疾病預防控制中心進(jìn)行序列測定，中國疾病預防控制中心要于28個(gè)工作日內反饋基因定型結果。

　　所有病例的采樣均由醫療機構完成，及時(shí)送至縣（區）級疾病預防控制機構或指定的檢測機構檢測。檢測機構將實(shí)驗室檢測結果于24小時(shí)內反饋給縣（區）級疾病預防控制機構；縣（區）級疾病預防控制機構接到結果后，于24小時(shí)內對檢測病例的傳染病報告卡信息進(jìn)行訂正，將其病例類(lèi)型訂正為“實(shí)驗室診斷”，并在“實(shí)驗室結果”處補填腸道病毒病原學(xué)分型信息。

　　各種標本采集和檢測方法詳見(jiàn)《手足口病標本采集及檢測技術(shù)方案》（附件1）。

　?。ㄈ┍O測信息分析與反饋。

　　各級疾病預防控制機構要每日對網(wǎng)絡(luò )直報系統進(jìn)行瀏覽，及時(shí)對報告的病例進(jìn)行審核、查重、訂正等工作，定期對監測數據進(jìn)行分析，判斷發(fā)病趨勢，發(fā)現異常升高或病例呈聚集性分布或出現重癥及死亡病例時(shí)，要及時(shí)核實(shí)并向同級衛生行政部門(mén)及上級疾病預防控制機構報告，并定期向下級疾病預防控制機構和醫療機構反饋疫情分析信息。

　　五、預防控制

　?。ㄒ唬┈F場(chǎng)調查處置。

　　發(fā)現手足口病聚集性病例、重癥或死亡時(shí)，縣（區）級及以上疾病預防控制機構要立即組織開(kāi)展現場(chǎng)調查處置。

　　1．流行病學(xué)調查。

　?。?）聚集性病例調查：了解聚集性病例的臨床表現、流行特征，以分析流行因素，為采取防控措施提供依據。要對首發(fā)或指示病例開(kāi)展流行病學(xué)調查，填寫(xiě)《手足口病個(gè)案調查表》（附件2）。

　?。?）重癥或死亡病例調查：詳細了解病例的基本信息、臨床癥狀、發(fā)病就診治療過(guò)程、感染傳播情況、病原檢測結果，以分析重癥及死亡病例的主要危險因素，填寫(xiě)《手足口病重癥或死亡病例個(gè)案調查表》（附件3）。調查結束后，各省級疾病預防控制中心應將結果錄入統一數據庫，報送中國疾病預防控制中心。

　?。?）專(zhuān)題調查：根據當地手足口病疫情特點(diǎn)及流行特征，可開(kāi)展專(zhuān)題調查，以了解當地的主要傳播方式以及感染危險因素等，為制定干預措施提供依據。專(zhuān)題調查的方案及其內容，應根據調查目的專(zhuān)門(mén)設計。

　?。?）醫療機構要協(xié)助疾病預防控制機構對病例進(jìn)行流行病學(xué)調查。

　　2．傳染源的管理。

　　患兒應及時(shí)就醫，并遵醫囑采取居家或住院方式進(jìn)行治療。居家患兒，家長(cháng)或監護人應在社區（村）醫生的指導下，密切關(guān)注患兒的病情變化，如發(fā)現神經(jīng)系統、呼吸系統、循環(huán)系統等相關(guān)癥狀時(shí)，應立即送醫院就診，同時(shí)，要盡量避免與其他兒童接觸。住院患兒應在指定區域內接受治療，防止與其他患兒發(fā)生交叉感染。

　　管理時(shí)限為自患兒被發(fā)現起至癥狀消失后1周。

　　鄉鎮衛生院/社區衛生服務(wù)中心、村衛生室/社區衛生服務(wù)站等負責本轄區居家治療的手足口病患兒的隨訪(fǎng)工作，掌握居家治療患兒的病情進(jìn)展情況。

　　3．標本采集和檢測。

　?。?）所有重癥和死亡病例均要采集標本，可以采集咽拭子、糞便或肛拭子、皰疹液、腦脊液、血清等，死亡病例還可采集腦、肺、腸淋巴結等組織標本。聚集性病例至少要采集2例病例標本開(kāi)展病原學(xué)檢測。

　?。?）醫療機構負責樣本采集，疾病預防控制機構應指導醫療機構進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)標本的采集。

　?。?）疾病預防控制機構根據本地的技術(shù)能力，對采集的標本開(kāi)展核酸檢測、病毒分離；不具備技術(shù)條件時(shí)，及時(shí)送上級機構進(jìn)行檢測（附件1）。

　　4．消毒措施。

　　病家、托幼機構和小學(xué)的消毒應在當地疾病預防控制機構的指導下，由單位及時(shí)進(jìn)行消毒，或由當地疾病預防控制機構負責對其進(jìn)行消毒處理。醫療機構的消毒由醫療機構安排專(zhuān)人進(jìn)行。消毒方法參見(jiàn)《消毒技術(shù)規范》（2002版）和《手足口病疫源地消毒指南》（附件4）。

　　5．健康教育。

　　各級醫療衛生機構應在政府領(lǐng)導下，與當地教育、宣傳、廣電等部門(mén)密切合作，充分利用12320公共衛生公益熱線(xiàn)、廣播、電視、報紙、網(wǎng)絡(luò )、手機短信、宣傳單/宣傳畫(huà)等多種方式，開(kāi)展手足口病防治知識的宣傳工作，使5歲以下兒童家長(cháng)及托幼機構工作人員等了解手足口病的臨床癥狀，掌握最基本的預防措施，強調保持良好的個(gè)人衛生習慣及環(huán)境衛生措施對于有效預防手足口病的重要性，動(dòng)員托幼機構老師和管理人員、兒童家長(cháng)成為手足口病防控工作的主動(dòng)參與者，形成群防群控。與重癥或死亡病例發(fā)病前1周或發(fā)病后有共同生活、居住史的5歲以下兒童，要對其家長(cháng)或監護人進(jìn)行健康教育，做好兒童的密切觀(guān)察，出現癥狀要及時(shí)就診和治療。

　?。ǘ┲攸c(diǎn)人群及重點(diǎn)機構的預防控制措施。

　　為降低人群手足口病的發(fā)病率，減少聚集性病例，避免醫院感染，各地要做好以散居兒童為主的重點(diǎn)人群和以托幼機構、醫療機構為主的重點(diǎn)場(chǎng)所的預防控制工作。

　　1．散居兒童的預防控制措施。

　?。?）飯前便后、外出回家后要用肥皂或洗手液等給兒童洗手；看護人接觸兒童前、替幼童更換尿布、處理糞便后均要洗手；

　?。?）嬰幼兒的尿布要及時(shí)清洗、曝曬或消毒；注意保持家庭環(huán)境衛生，居室要經(jīng)常通風(fēng)，勤曬衣被；

　?。?）嬰幼兒使用的奶瓶、奶嘴及兒童使用的餐具使用前后應充分清洗、消毒；不要讓兒童喝生水、吃生冷食物；

　?。?）本病流行期間不宜帶兒童到人群聚集、空氣流通差的公共場(chǎng)所；避免接觸患病兒童；

　?。?）兒童出現發(fā)熱、出疹等相關(guān)癥狀要及時(shí)到醫療機構就診；

　?。?）居家治療的患兒避免與其他兒童接觸，以減少交叉感染；父母要及時(shí)對患兒的衣物進(jìn)行晾曬或消毒，對患兒糞便及時(shí)進(jìn)行消毒處理。

　　2．托幼機構預防控制措施。

　?。?）每日進(jìn)行晨檢，發(fā)現可疑患兒時(shí)，要采取立即送診、居家觀(guān)察等措施；對患兒所用的物品要立即進(jìn)行消毒處理；

　?。?）出現重癥或死亡病例，或1周內同一班級出現2例及以上病例，建議病例所在班級停課10天；1周內累計出現10例及以上或3個(gè)班級分別出現2例及以上病例時(shí)，經(jīng)風(fēng)險評估后，可建議托幼機構停課10天；

　?。?）教育、指導兒童養成正確洗手等良好的衛生習慣；老師要保持良好的個(gè)人衛生狀況；

　?。?）教室和宿舍等場(chǎng)所要保持良好通風(fēng)；定期對玩具、兒童個(gè)人衛生用具（水杯、毛巾等）、餐具等物品進(jìn)行清洗消毒；

　?。?）定期對活動(dòng)室、寢室、教室、門(mén)把手、樓梯扶手、桌面等物體表面進(jìn)行擦拭消毒；

　?。?）托幼機構應每日對廁所進(jìn)行清掃、消毒，工作人員應戴手套，工作結束后應立即洗手；

　?。?）托幼機構應配合衛生部門(mén)采取手足口病防控措施。

　　3．醫療機構的預防控制措施。

　?。?）各級醫療機構應加強預檢分診，專(zhuān)辟診室（臺）接診發(fā)熱、出疹的病例。增加候診及就診等區域的清潔消毒頻次，室內清掃時(shí)應采用濕式清潔方式；

　?。?）醫務(wù)人員在診療、護理每一位病例后，均應認真洗手或對雙手消毒，或更換使用一次性手套；

　?。?）診療、護理手足口病病例過(guò)程中所使用的非一次性?xún)x器、體溫計及其他物品等要及時(shí)消毒；

　?。?）對住院患兒使用過(guò)的病床及桌椅等設施和物品必須消毒后才能繼續使用；

　?。?）患兒的呼吸道分泌物和糞便及其污染的物品要進(jìn)行消毒處理。

　　附件：1．手足口病標本采集及檢測技術(shù)方案

　　2．手足口病個(gè)案調查表

　　3．手足口病重癥或死亡病例個(gè)案調查表

　　4．手足口病疫源地消毒指南

　　附件1

　　手足口病標本采集及檢測技術(shù)方案

　　一、采集標本的種類(lèi)、保存和運輸

　?。ㄒ唬┘S便標本。

　　采集病人發(fā)病3日內的糞便標本，用于病原檢測。糞便標本采集量5-8g/份，采集后立即放入無(wú)菌采便管內，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽，4℃暫存12小時(shí)內送達實(shí)驗室，-20℃以下低溫冷凍保藏，需長(cháng)期保存的標本存于-70℃冰箱。

　?。ǘ┭适米訕吮?。

　　采集病人發(fā)病3日內的咽拭子標本，用于病原檢測。用專(zhuān)用采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側扁桃體部位，應避免觸及舌部；迅速將棉簽放入裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的15ml外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。4℃暫存并在12小時(shí)內送達實(shí)驗室，-20℃以下低溫冷凍保藏，需長(cháng)期保存的標本存于-70℃冰箱。

　?。ㄈ┭鍢吮?。

　　各?。▍^、市）在手足口病流行年份中均應采集EV71 和CVA16感染的手足口病患兒的雙份血清。采集急性期（發(fā)病0-7d）和恢復期（發(fā)病14-30d）雙份配對血清用于闡明和分析EV71和CVA16感染后IgG和IgM抗體的動(dòng)態(tài)變化，評價(jià)血清學(xué)抗體試劑盒的敏感性和特異性。靜脈采集3-5ml全血，置于真空無(wú)菌采血管中，自凝后，分離血清，將血清移到2ml外螺旋的血清保存管中，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。將血清置于-20℃以下冰箱中冷凍保存。

　?。ㄋ模┌捳钜?。

　　在手足口病的實(shí)驗室診斷中，從皰疹液中分離到病毒即可確診該病毒為病因，可同時(shí)采集多個(gè)皰疹作為一份標本。先用75%的酒精對皰疹周?chē)钠つw進(jìn)行消毒，然后用消毒針將皰疹挑破用棉簽蘸取皰疹液，迅速將棉簽放入內裝有3-5ml保存液（含5%牛血清維持液或生理鹽水，推薦使用維持液）的采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。所采集標本4℃暫存立即（12h內）送達實(shí)驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長(cháng)期保存的標本存于－70℃冰箱。

　?。ㄎ澹└厥米訕吮?。

　　采集病人發(fā)病3日內的肛拭子標本，用于病原檢測。用專(zhuān)用采樣棉簽，從患兒肛門(mén)輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數下，拔出后,迅速將棉簽放入裝有3－5ml保存液（含5%牛血清細胞維持液）的15ml外螺旋的采樣管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，并密封，以防干燥。

　?。┦瑱z標本。

　　采集腦、肺和腸淋巴結等重要組織標本，每一采集部位分別使用單獨的消毒器械。每種組織應多部位取材，每部位應取2-3份約5-10g的組織，淋巴結2個(gè)，分別置于15ml-50ml無(wú)菌的有外螺旋蓋的凍存管中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。

　?。ㄆ撸┠X脊液標本。

　　出現神經(jīng)系統癥狀的病例，可采集腦脊液標本，進(jìn)行病毒分離或核酸檢測。采集時(shí)間為出現神經(jīng)系統癥狀后3天內，采集量為1.0-2.0ml。采集后立即裝入無(wú)菌帶墊圈的凍存管中，4℃暫存立即(12h內)送達實(shí)驗室，－20℃以下低溫冷凍保藏，需長(cháng)期保存的標本存于－70℃冰箱。但EV71感染神經(jīng)系統時(shí)，很難在腦脊液中檢測到EV71病原。

　　臨床標本在運輸和貯存過(guò)程中要避免反復凍融。標本采集后要全程冷藏或冷凍保存和運輸，12小時(shí)內送達實(shí)驗室。依照《人間傳染的病原微生物名錄》，腸道病毒或潛在含有腸道病毒的標本按B類(lèi)包裝，置于冷藏保存盒內運輸，盡量縮短運輸時(shí)間?？刹捎藐懧坊蚝娇盏榷喾N運輸方式，但在運輸過(guò)程中應采取保護措施，避免強烈震動(dòng)、重力擠壓等現象。在送到省、地、市級CDC實(shí)驗室時(shí)，包裝盒內應帶冰且包裝完整。在上送標本的同時(shí)，需附帶相關(guān)的《手足口病病例臨床標本采樣登記表》。

　　二、標本采集注意事項

　　在手足口病的實(shí)驗室診斷中，從皰疹液或腦脊液中分離到病毒即可診斷該病毒為病因。用于采集咽拭子的無(wú)菌拭子要放在標本保存液中，如含5%牛血清維持液。用于分子生物學(xué)診斷的標本采集與病毒分離標本的采集方法一樣。為了保證檢測結果的準確性和有效性，標本應在病例發(fā)病后盡早采集，盡快檢測。不能立即檢測的標本應冷凍保存。對于血清學(xué)診斷，急性期血清應該在發(fā)病后盡早采集，恢復期血清在發(fā)病兩周后采集。標本保存液的配置見(jiàn)下表：

　　 保存液

　　Eagle`s液(MEM) 80.5ml

　　3%L-谷氨酰胺200mM 1.0ml

　　胎牛血清 5.0ml

　　7.5%NaHCO3溶液 3.5ml

　　青、鏈霉素

　?。ǜ?0000U/ml） 10ml

　　三、實(shí)驗室檢測操作流程

　?。ㄒ唬┎《痉蛛x。

　　1.試劑配置

　?。?）細胞的生長(cháng)液、維持液的配制見(jiàn)下表：

　　 生長(cháng)液（GM） 維持液（MM）

　　Eagle`s液(MEM) 86.5ml 92.5ml

　　3%L-谷氨酰胺200mM 1.0ml 1.0ml

　　胎牛血清 10.0ml 2.0ml

　　7.5%NaHCO3溶液 2.5ml 3.5ml

　　青、鏈霉素

　?。ǜ?0000U/ml） 1.0ml 1.0ml

　?。?）糞便標本和肛拭子的處理液

　　完全PBS液中加入P．S溶液，終濃度為青霉素100單位/ml，鏈霉素為100μg/ ml。

　　完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即為完全PBS工作液。

　　A液：

　　試劑品名 加入量

　　NACL 8.00g

　　KCL 0.20g

　　Na2HPO4(無(wú)水) 0.91g

　　KH2PO4 0.12g

　　用600～800ml蒸餾水溶解以上鹽類(lèi)，加蒸餾水補至1000ml，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌，即為不完全PBS工作液（不含鈣、鎂離子）。

　　B液：

　　試劑品名 加入量

　　MgCl2.6H2O 0.10g

　　溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。

　　C液：

　　試劑品名 加入量

　　CaCl2 0.10g

　　溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。

　　2．病毒分離細胞系

　　許多細胞系可支持人腸道病毒（如EV71、CVA16）生長(cháng)。

　　對于檢測手足口病的病原來(lái)說(shuō)，建議所有懷疑含EV71、CVA16等腸道病毒感染的標本均需接種到以下兩種細胞系：

　　? RD細胞，來(lái)源于人橫紋肌肉瘤細胞。

　　? HEp-2細胞，來(lái)源于人喉癌上皮細胞。

　　3．標本的處理

　?。?）糞便標本和肛拭子的處理

　　操作步驟：

　　1）在離心管上標記標本號；

　　2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；

　　3）在生物安全柜中將每一份糞便標本取大約2g加入標記好的離心管中（確保離心管上的標號與原始標本的標號一致）；肛拭子為2ml；

　　4）剩余的原始標本最好留在原容器中，凍存于－20℃；

　　5）確保擰緊離心管，用機械震蕩器劇烈震蕩20min；

　　6）在確保離心機的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機在1500g條件下離心20min；

　　7）在生物安全柜中將每1份標本的上清液分別吸入2個(gè)有外螺旋蓋的凍存管中（如果上清液不清澈，應再用氯仿處理1次）；

　　8） 1管糞便懸液凍存于－20℃作為備份，另1管存于4-8℃以備接種。

　?。?）皰疹液標本的處理

　　皰疹液標本通常直接用于RNA提取或病毒分離。

　?。?）腦脊液標本的處理

　　腦脊液標本通常直接用于病毒分離。

　?。?）咽拭子標本的處理

　　咽拭子要在標本運輸（保存）液中充分攪動(dòng)（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，用于病毒分離時(shí)，需要凍融一次（防止多次凍融），使細胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4℃條件下，10000 rpm離心20min，用上清接種到細胞上或直接提取RNA。如果發(fā)現有細菌污染，須用濾器過(guò)濾除菌。

　　4．接種和觀(guān)察（病毒分離）

　?。?）通常使用８ml的斜面試管培養細胞，傳細胞時(shí)，每管加細胞培養液1.5ml。顯微鏡下觀(guān)察單層細胞，以確保細胞是健康、無(wú)污染的。一個(gè)健康的單層細胞會(huì )在傳代后48小時(shí)左右形成；

　?。?）倒掉生長(cháng)液（GM），換上1-1.2ml的維持液（MM）；

　?。?）每一份標本需要同時(shí)接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞，正確標記每支細胞培養管（包括標本的編號、日期、傳代數）；

　?。?）每一種細胞至少標記一管作為陰性對照；

　?。?）每支試管接種0.2ml的標本懸液，培養溫度要求36℃。

　?。ɑ蛘呤褂梦降姆椒ń臃N病毒：接種標本前，倒掉生長(cháng)液（GM），每支試管接種0.2ml的標本懸液，培養溫度為36℃；吸附1小時(shí)后，換上1.5ml的維持液（MM）。同樣每份標本需同時(shí)接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞。

　?。?）使用倒置顯微鏡每天觀(guān)察細胞培養管，以觀(guān)察有特征性的腸道病毒致細胞病變效應（CPE）的出現（如細胞變圓，折光增強并脫離管壁等）；

　?。?）記錄接種管和對照管細胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE（1+—4+）、提示細胞受毒性反應、老化或污染的影響而發(fā)生的變化（1+，<25%; 2+, 25%-50%; 3+, 50%-75%; 4+, 75%-100%）；

　?。?）如果有特征性的腸道病毒CPE出現，要如實(shí)記錄，并觀(guān)察直到75%的細胞發(fā)生變化（3+ CPE），然后儲藏在－20℃以備二次傳代；

　?。?）第一代培養見(jiàn)可疑細胞病變時(shí)應繼續傳代，待細胞病變穩定出現后－20℃或－70℃凍存；

　?。?0）一代陽(yáng)性分離物再傳二代，如果又有明顯的CPE出現，將病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于一代病毒，所以選用二代病毒進(jìn)行鑒定；

　?。?1）如果7d之后沒(méi)有CPE出現，那么盲傳1代繼續觀(guān)察7d。（注意：同一病例標本的細胞培養物不能混在一起再傳代，例如：不同細胞的培養物應單獨傳代）；

　?。?2）盲傳兩代后，仍然沒(méi)有出現CPE的，則判定為陰性；

　?。?3）注意：如果接種后24h內出現CPE，很可能是標本中的非特異性成分導致的毒性反應。取100μl陽(yáng)性分離物傳二代，繼續觀(guān)察；或者在接種標本吸咐1h后用維持液清洗細胞層，可能會(huì )降低毒性反應；

　?。?4）幾個(gè)概念：

　　A：毒性反應：如果在接種后1-2d內細胞快速凋亡，這可能是由于標本中含有毒性物質(zhì)而導致的非特異性毒性反應。這些已接種標本的試管應在-20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類(lèi)型細胞中（此時(shí)是第二代）。如果又出現了毒性反應，那么應該取原始標本用PBS稀釋10倍，再次接種到同種細胞中。這時(shí)應被認為是第一代。

　　B：微生物污染：由于細菌污染而造成培養液混濁或細胞死亡經(jīng)常使病毒造成的CPE無(wú)法確定或根本無(wú)法出現。重新取原始標本，用氯仿或抗生素處理，按上述步驟重新接種到新鮮細胞上。

　　C：盲傳：有時(shí)一周之后傳代細胞會(huì )老化，甚至細胞對照也出現了病變。這時(shí)已接種標本的試管應在-20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類(lèi)型的新鮮單層細胞中，再觀(guān)察7-10d。如果盲傳兩代后仍然沒(méi)有產(chǎn)生CPE，那么認為這個(gè)標本是陰性的。

　　5．病毒分離結果解釋

　　RD細胞支持HFMD的主要病原體——CVA16和EV71等多種腸道病毒的復制，CVA16和EV71均能在RD細胞培養中引起特殊的腸道病毒致細胞病變效應（CPE），表現為細胞圓縮、分散、胞漿內顆粒增加，最后細胞自管壁脫落。但相同滴度的CVA16和EV71在RD細胞中生長(cháng)的速度不同，EV71的生長(cháng)速度要快于CVA16，表現為EV71感染RD細胞后出現CPE的時(shí)間比CVA16早，EV71接種細胞后出現CPE很快，但CVA16一般要經(jīng)過(guò)2次以上傳代才出現明顯的CPE。

　　若在使用RD細胞分離的同時(shí)再增加HEp-2細胞，可提高腸道病毒的分離率（分離出其他可能致HFMD的病原體，如一些柯薩奇B組病毒）。但CVA16和EV71在HEp-2細胞中均不繁殖。

　?。ǘy定人雙份血清標本的中和抗體滴度。

　　比較患者急性期血清與恢復期血清中和抗體滴度，可作為腸道病毒感染的血清學(xué)診斷方法，最常用的是中和實(shí)驗，即用微量板法測定抗體滴度，是目前人腸道病毒抗體檢測的最常用方法，該方法精確且具有型特異性。

　　作為腸道病毒感染的診斷方法之一，可以測定血清中腸道病毒中和抗體的滴度，通常用急性期血清與恢復期血清滴度進(jìn)行比較，抗體滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。但是，腸道病毒隱性感染也很常見(jiàn)，所以在評估檢測結果時(shí)就要小心一些。在中和實(shí)驗中，一般要用人腸道病毒參考毒株（即原型株，EV71原型株為BrCr株，CVA16原型株為G-10株）或流行株，有時(shí)同時(shí)（或單獨）使用臨床分離株會(huì )有助于得到更準確的檢測結果。

　　使用對腸道病毒敏感的細胞，如RD細胞。用病毒（血清）稀釋液（下面液體配制中的C液，可用維持液代替）稀釋血清和制備病毒懸液，因為是用病毒來(lái)確定血清中抗體的滴度，所以要使用參考病毒（原型株），但有時(shí)使用所分離到的毒株（臨床分離株）有助于得到更準確的檢測結果，但分離株的滴度（100 CCID50/0.05ml）要事先測定。

　　中和實(shí)驗的檢測原理：病毒感染敏感靶細胞后，引起細胞形態(tài)學(xué)變化，出現CPE，特異性中和抗體與病毒結合后，可使病毒顆粒失去感染性，抑制CPE的出現。

　　1．液體配制

　　A液：血清處理液：（100ml中含下列試劑成份）

　　MEM 85ml

　　3% L-谷氨酰胺 1ml

　　7.5%碳酸氫鈉 2ml

　　胎牛血清 2ml

　　青、鏈霉素（各10000U/ml） 10ml

　　B液：細胞營(yíng)養液：（按生長(cháng)液配方配制，100ml中含下列試劑成份）

　　MEM 85ml

　　3% L-谷氨酰胺 1ml

　　7.5%碳酸氫鈉 2ml

　　HEPES 1ml

　　胎牛血清 10ml

　　青、鏈霉素（各10000U/ml） 1ml

　　C液：病毒（血清）稀釋液：（按維持液配方配制，100ml中含下列液體）

　　MEM 93ml

　　3% L-谷氨酰胺 1ml

　　7.5%碳酸氫鈉 2ml

　　HEPES 1ml

　　胎牛血清 2ml

　　青、鏈霉素（各10000U/ml） 1ml

　　2．攻擊病毒CCID50滴定和滴度梯度制備

　?。?）將增殖后的病毒懸液凍融3次，然后在4℃、12000rpm條件下離心10min，取上清液分裝于10支凍存管中，每管1.5ml，一般每管應在一次試驗中用完，有剩余應高壓后廢棄；

　?。?）加Eagle液10倍系列稀釋為10-1至10-8病毒液，各加入細胞板內，每孔50μl，每稀釋度4孔細胞；

　?。?）每孔加細胞懸液50μl，同時(shí)設細胞對照（50μl稀釋液+50μl細胞懸液）， 36℃培養7d，觀(guān)察細胞病變；

　?。?）按Behrens-K?rber公式計算出分離病毒株的CCID50；

　　log CCID50 = L-d (S-0.5)，其中：

　　L = 實(shí)驗中使用的最低稀釋度的對數值；

　　d = 稀釋梯度的對數值；

　　S = 終判時(shí)陽(yáng)性部分的總和（即出現CPE的細胞孔所占的比例之和）。

　?。?）正式試驗前應先滴定攻擊病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 CCID50的病毒載量；

　?。?）按照計算好的稀釋比例配制攻擊病毒，求出試驗所需的病毒總量（即100 CCID50/0.05ml）；

　?。?）取3支小試管，每只加病毒稀釋液（液體配制中的C液）0.9ml；

　?。?）用帶濾芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已經(jīng)稀釋好的攻擊病毒液（即100CCID50/0.05ml）到第一支小試管中，換另一支ART吸尖，輕輕并徹底地混勻，避免產(chǎn)生大量氣溶膠，按照此方法依次稀釋至1 CCID50/0.05ml和0.1 CCID50/0.05ml。

　　3．稀釋血清

　?。?）發(fā)病1-3d內采取患者急性期血清，發(fā)病后2-4周采取恢復期血清，分別凍存在-20℃備檢。

　?。?）取無(wú)菌小試管若干支（每份血清使用一支）置試管架上，每管加血清處理液（上面液體配制中的A液）0.3ml，加待測血清0.1ml，蓋緊塞子，震搖混勻，放4℃冰箱過(guò)夜，即為1：4稀釋血清。次日56℃、30min滅活。

　?。?）打開(kāi)獨立無(wú)菌包裝48孔組織培養板，縱向使用，每孔加血清稀釋液（上面液體配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器吸取處理過(guò)的血清0.1ml加入第一孔（即為1：16），吹吸8-10次，吸0.1ml加入第二孔（即為1：64），依次至1：1024，血清稀釋的過(guò)程中不必更換吸尖。即每份血清標本進(jìn)行4倍倍比稀釋?zhuān)?：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。

　?。?）每份血清標本的每個(gè)稀釋度都要平行做兩孔。

　　4．病毒中和抗體測定的操作步驟：

　?。?）取一塊96孔板橫向使用，每塊板可以做8份（4對）待測血清，版面設計如下圖所示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀釋度的待測血清0.05ml，不必更換吸尖，在A(yíng)3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀釋度的待測血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀釋度的待測血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀釋度的待測血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀釋度的待測血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）為每份待測血清對照孔，每孔中補加稀釋液0.05ml；

　?。?）上述孔中分別加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已經(jīng)稀釋為100 CCID50/0.05ml）；

　?。?）蓋好蓋子后用微量板混勻器混勻，放入36℃ CO2孵箱中孵育2h；

　?。?）另取一塊96孔板縱向使用，做100 CCID50/0.05ml病毒滴度的核實(shí)（每次實(shí)驗都必須做）。每孔先加病毒稀釋液（試劑配制中的C液）0.05ml，然后從0.1 CCID50/0.05ml加起，每孔0.05ml，每個(gè)稀釋度8孔，不必更換吸尖，一直加至100 CCID50/0.05ml；同時(shí)留出4孔做為細胞對照孔，每孔加入0.1ml病毒稀釋液，然后放入4℃冰箱中暫存；

　?。?）在孵育期間，用消化液消化細胞，準備細胞懸液，細胞懸液的濃度為2×105個(gè)/ml，每塊96孔板至少需要準備10ml；

　?。?）孵育結束后每個(gè)待測血清孔、血清對照孔（待檢標本板）和病毒回滴孔和細胞對照孔（病毒回滴板）分別加入0.1ml細胞懸液，然后用微量板混勻器混勻，放入36℃ CO2孵箱中孵育培養；

　?。?）使用倒置顯微鏡每天觀(guān)察CPE，并記錄病毒滴定結果，以不產(chǎn)生細胞病變的血清最高稀釋度的倒數為終點(diǎn)效價(jià)。當100 CCID50/0.05ml的病毒對照孔出現完全病變時(shí)，判定最終結果（約5~7d）；

　?。?）注意：如果病毒對照結果（病毒回滴）不在32~320 CCID50/0.05ml的范圍內，實(shí)驗無(wú)效，就要重復實(shí)驗。

　　5．結果判定

　　當最高稀釋度血清的2孔中有1孔出現細胞病變，另一孔不出現細胞病變，該稀釋度的倒數計即為該血清標本的中和抗體效價(jià)；當高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數即為該血清標本的中和抗體效價(jià)；當兩個(gè)相鄰稀釋度血清均出現1孔細胞病變，另1孔不出現細胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數即為該血清標本的中和抗體效價(jià)。

　　對于HFMD的雙份血清中和實(shí)驗結果來(lái)說(shuō)，如果恢復期血清較急性期血清EV71或CVA16中和抗體滴度出現4倍或4倍以上增高即可確診；如果恢復期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現4倍或4倍以上增高可證實(shí)該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關(guān)實(shí)驗證實(shí)；如果單份血清中和抗體滴度大于1:256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為1:128判定為可疑陽(yáng)性。

　?。ㄈ┠孓D錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）。

　　1．RNA提取

　　可使用多種商業(yè)化試劑盒來(lái)提取RNA，針對臨床標本應選擇質(zhì)量較高的“用于臨床標本病毒RNA提取的試劑盒”，也可使用全自動(dòng)RNA提取儀進(jìn)行提取。針對病毒分離物，核酸提取比較容易，大部分商業(yè)化RNA提取試劑盒都可有效的提取到RNA。RNA提取依據使用的試劑不同，嚴格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

　　2．逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）

　?。?）引物序列合成

　　國家脊灰實(shí)驗室自行設計3對引物，分別為人腸道病毒通用引物、EV71特異性引物和CVA16特異性引物。各省CDC依據引物序列在質(zhì)量有保證的公司合成,引物合成后,需要做預實(shí)驗，保證引物合成沒(méi)有質(zhì)量問(wèn)題后,分發(fā)給地市級CDC。

　　1）人腸道病毒（包括EV71、CVA16）核酸檢測通用引物序列：

　　PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3`

　　PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`

　　2）EV71核酸檢測引物序列：

　　EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3`

　　EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`

　　3）CVA16核酸檢測引物序列：

　　CVA16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`

　　CVA16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`

　?。?）實(shí)驗設計

　　1）在PCR記錄紙（實(shí)驗記錄紙）上記錄本次實(shí)驗操作者姓名，實(shí)驗日期，所鑒定標本的名稱(chēng)以及標本的順序，與PCR儀排列的順序一致。

　　2）標記好加標本和對照的PCR管（陽(yáng)性對照，陰性對照和試劑對照）。

　　A：陽(yáng)性對照：參比RNA，省級CDC提供（只是在初次使用，常規不建議使用，以防污染）。

　　B：陰性對照：使用正常細胞RNA或臨床標本腸道病毒陰性的RNA（每次實(shí)驗要設立）。

　　C：試劑對照：用去離子水代替標本（試劑初次使用時(shí)必須做）。

　?。?）RT-PCR擴增反應和條件

　　1）從臨床標本或病毒中提取的RNA和各種RT-PCR試劑應該一直放在冰浴盒上；

　　2）配下列試劑主溶液：

　　10×PCR Buffer???????????????????????????????????????????????????????????????????5.0μl

　　dNTPs（2.5mM each）???????????????????????????????????????????????????????2.0μl

　　上游引物（0.1μg/μl）?????????????????????????????????????????????????????????1.0μl

　　下游引物（0.1μg/μl）?????????????????????????????????????????????????????????1.0μl

　　RNA酶抑制劑（RNasin,40U/μl）??????????????????????????????????????0.5μl

　　Taq DNA聚合酶（5U/μl）?????????????????????????????????????????????????0.5μl

　　AMV逆轉錄酶（10U/μl）??????????????????????????????????????????????????1.0μl

　　模板RNA??????????????????????????????????????????????????????????????????????????3.0μl

　　RNase Free dH2O???????????????????????????????????????????????????????????36.0μl

　　 50.0μl

　　3）在PCR儀上進(jìn)行RT-PCR反應，反應步驟如下：

　　42℃????????????????????????45min

　　95℃????????????????????????3min

　　95℃????????????????????????20s

　　45℃????????????????????????25s ×32個(gè)循環(huán)

　　72℃????????????????????????30s

　　72℃????????????????????????10min

　　4℃????????????????????????Soak

　　3．電泳分析

　?。?）將已經(jīng)聚合的3%的瓊脂糖凝膠放在電泳裝置上；

　?。?）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 電泳載樣緩沖液（每個(gè)反應需1μl）。再加上5μl的PCR反應產(chǎn)物與之混合；

　?。?）將電泳緩沖液倒在電泳裝置中，用吸尖將樣品與載樣緩沖液的混合溶液加到孔中；

　?。?）蓋上蓋子，接通電源，以10V/cm電壓（恒定電壓）電泳，大約35-40min，直到溴酚藍跑到凝膠的底部的時(shí)候，停止電泳；

　?。?）將膠取出，并注意保持凝膠的方向；

　?。?）在1μg/ml的溴化乙錠溶液中染色15min，

　　注意：溴化乙錠溶液是有毒、致畸、并且致腫瘤的物質(zhì)，操作時(shí)要加小心，并戴雙層手套。如果儲存在避光的容器中，溴化乙錠溶液可以重復使用。溴化乙錠廢棄物按醫療廢棄物中化學(xué)品的有關(guān)規定處理。

　?。?）在蒸餾水中涮一下凝膠；

　?。?）在紫外透射儀下觀(guān)察PCR產(chǎn)物電泳結果，并照相作記錄。

　　有條件的實(shí)驗室可以使用全自動(dòng)電泳分析儀。

　　4．結果解釋

　　使用全自動(dòng)電泳分析儀的實(shí)驗室可以通過(guò)儀器自動(dòng)讀取PCR產(chǎn)物大小，來(lái)判斷結果。通過(guò)瓊脂糖凝膠做PCR產(chǎn)物電泳的實(shí)驗室，需要參照DNA分子量對照對照，比較標本的PCR產(chǎn)物與陽(yáng)性對照的PCR產(chǎn)物在凝膠上的位置以及大小來(lái)解釋結果。

　　RT-PCR實(shí)驗結果解釋表

　　待檢標本RT-PCR結果 鑒定結果

　　HEV(-), EV71(-), CVA16(-) 非腸道病毒（NEV）

　　HEV(+), EV71(-), CVA16(-) 非EV71、CVA16的其它腸道病毒

　　HEV(+), EV71(+), CVA16(-) EV71

　　HEV(+), EV71(-), CVA16(+) CVA16

　　(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）

　　1. 病毒核酸提取

　　參考常規RT-PCR病毒核酸提取步驟和注意事項。

　　2. Real-time RT-PCR （rRT-PCR）

　　依據不同廠(chǎng)家的試劑盒，嚴格按相應說(shuō)明書(shū)操作和判斷結果。有5種試劑盒，分別為One Step Real-time PCR法檢測EV71病毒核酸（單通道檢測）；One Step Real-time PCR法檢測CVA16核酸（單通道檢測）；One Step Real-time PCR法檢測腸道病毒核酸（單通道檢測）；One Step Real-time PCR法同時(shí)檢測EV71和CVA16核酸（雙通道檢測）；One Step Real-time PCR法同時(shí)檢測EV71和腸道病毒核酸（雙通道檢測）。下面舉2個(gè)例子來(lái)說(shuō)明單通道檢測和雙通道檢測的操作規程和注意事項。

　?。?） One Step Real-time PCR法檢測EV71病毒核酸（單通道檢測）

　?、俜磻w系配置：反應體系共25μl，模板量可根據樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5μl的RNA模板量），不夠部分以水補足。如選用另外試劑盒，反應體系及條件隨之變化。

　　a.從試劑盒中取出相應的試劑，反應液在室溫融化后，瞬時(shí)離心，按n+1配置反應體系（n=樣本數+1管陽(yáng)性對照+1管陰性對照），每個(gè)測量反應體系配置如下表：

　　試劑組成 1份樣品的量

　　熒光RT-PCR反應液 12.5μl

　　逆轉錄酶 0.5μl

　　Taq酶 0.5μl

　　引物和探針 1.5μl

　　H2O 5μl

　　b.將上述反應液混勻離心后，按照每管20μL分裝于各熒光PCR儀適用的PCR管中。

　　c.加樣：將提取好的樣本RNA，分別加入上述分裝好的PCR反應管中，模板量可根據樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5ul模板量），不夠部分以水補足?？偡磻w積25μL。

　?、跓晒?a href='http://www.segmentsecurity.com/html/795308931.html' target='_blank'>RT-PCR循環(huán)條件設置

　　程序 循環(huán)數 溫度（攝氏度） 反應時(shí)間（分鐘：秒）

　　1 1 42℃ 30min

　　2 1 95℃ 2min

　　3 40 95℃ 10sec

　　 60℃ 35sec

　　 60℃時(shí)收集熒光信號

　?、蹖φ赵O置

　　陰性對照：核酸提取時(shí)以滅菌雙蒸水代替標本，每次實(shí)驗應設立。

　　陽(yáng)性對照：由省級實(shí)驗室提供EV71陽(yáng)性核酸（只在評價(jià)試劑時(shí)使用）

　?、芙Y果分析條件設定和結果判斷

　　閾值設定

　　原則以閾值線(xiàn)剛好超過(guò)正常陰性對照擴增曲線(xiàn)的最高點(diǎn)，結果顯示陰性為準，或可根據儀器噪音情況進(jìn)行調整。

　　Ct值≤35.0的樣本為陽(yáng)性。

　　38.0> Ct值>35.0的樣本為臨界值。

　　Ct值≥38.0的樣本或無(wú)數值的標本為陰性。

　?。?） One Step Real-time PCR法同時(shí)檢測EV71和CVA16核酸（雙通道檢測）

　　雙通道可以同時(shí)檢測EV71和CVA16核酸,在提取核酸后短時(shí)間(2.5小時(shí))內檢測到標本中是否含EV71或CVA16核酸。

　?、俜磻w系配置

　　反應體系共25μl，模板量可根據樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5μl模板量），不夠部分以水補足。如選用另外試劑盒，反應體系及條件隨之變化。

　　a.先將試劑解凍，從試劑盒中取出相應的試劑，反應液在室溫融化后，瞬時(shí)離心，按n+1配置25μl反應體系（n=樣本數+1管陽(yáng)性對照+1管陰性對照），每個(gè)測量反應體系配置如下表：

　　b.將下述反應液混勻離心后，按照每管20μL分裝于適用的PCR管中。

　　試劑組成 1份樣品的量

　　熒光RT-PCR反應液 12.5μl

　　逆轉錄酶 0.5μl

　　Taq酶 0.5μl

　　引物和探針 3μl

　　H2O 3.5μl

　　c.加樣：將提取好的樣本RNA，分別加入上述分裝好的PCR反應管中，模板量可根據樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5ul模板量），不夠部分以水補足?？偡磻w積25μL。

　?、跓晒?a href='http://www.segmentsecurity.com/html/795308931.html' target='_blank'>RT-PCR循環(huán)條件設置

　　程序 循環(huán)數 溫度（攝氏度） 反應時(shí)間

　　1 1 42℃ 30 min

　　2 1 95℃ 2 min

　　3 40 95℃ 10 s

　　 60℃ 35 s

　　 60℃時(shí)收集熒光信號

　?、劢Y果分析條件設定和結果判斷

　　陰性對照：核酸提取時(shí)以滅菌雙蒸水代替標本。

　　陽(yáng)性對照：提取好的陽(yáng)性核酸作為模板RNA。

　　閾值設定原則以閾值線(xiàn)剛好超過(guò)正常陰性對照擴增曲線(xiàn)的最高點(diǎn)，結果顯示陰性為準，或可根據儀器噪音情況進(jìn)行調整。

　　Ct值≤35.0的樣本為陽(yáng)性。

　　Ct值無(wú)數值的標本和Ct值≥38.0的樣本為陰性樣本。

　　38.0> Ct值>35.0的樣本為臨界值。

　　注：熒光PCR同時(shí)讀取FAM和HEX，進(jìn)行雙通道檢測，FAM熒光Ct值為CVA16的結果，HEX熒光 Ct值為EV71的結果。

　　四、生物安全

　　根據2006年1月11日衛生部制定的《人間傳染的病原微生物名錄》，柯薩奇病毒、?？刹《?、EV71型和目前分類(lèi)未定的其他腸道病毒均屬于危害程度第三類(lèi)的病原微生物。因此在保證安全的前提下，對臨床和現場(chǎng)的未知樣本檢測操作可在生物安全II級或以上防護級別的實(shí)驗室進(jìn)行，涉及病毒分離培養的操作，應加強個(gè)體防護和環(huán)境保護。

　　操作糞便、腦脊液和血液等臨床標本時(shí)要特別注意生物安全，要在II級生物安全柜中進(jìn)行標本處理、病毒分離和病毒鑒定，無(wú)脊灰疫苗免疫史的人員要進(jìn)行脊灰疫苗免疫。

　　滅活后的血清抗體檢測與PCR檢測可在生物安全I級實(shí)驗室進(jìn)行。

　　所有操作應遵守國家相關(guān)法律法規。